顯微攝影
顯微攝影的反差強(qiáng)一些為好,影響反差的因素有以下五個(gè)方面:標(biāo)本本身對(duì)反差的影響 標(biāo)本切片厚會(huì)產(chǎn)生光的折反射,同時(shí)細(xì)部結(jié)構(gòu)產(chǎn)生重疊。標(biāo)本新鮮、色彩鮮艷反差強(qiáng)。標(biāo)本載物片厚或蓋片厚、有色、有水紋都會(huì)降低反差。照明對(duì)反差的影響:照明應(yīng)適中,否則會(huì)降低反差,太亮?xí)_擊標(biāo)本細(xì)部結(jié)構(gòu),太暗會(huì)使光路中的臟物呈現(xiàn)在影屏上。光束直徑與視場(chǎng)直徑一致時(shí)反差強(qiáng),光束直徑大于視場(chǎng)直徑就會(huì)降低反差。集光器與虹彩對(duì)反差的影響:集光器過(guò)低、虹彩與光欄小,都會(huì)降低反差,所以要依具體情況升降集光器或開(kāi)放虹彩。虹彩光闌的直徑必須與物鏡口徑一致。濾色片對(duì)反差的影響:用補(bǔ)色濾色片反差強(qiáng),用統(tǒng)一色濾色片反差弱。 光學(xué)顯微攝影的反差雖然是大些為好,但也要適當(dāng)處理,不然反差過(guò)大就會(huì)損失細(xì)部結(jié)構(gòu),同時(shí)也會(huì)影響分辨率,同樣不能得到完美的效果。 現(xiàn)代光學(xué)顯微鏡,基于不同用途、種類(lèi)繁多,如有生物顯微鏡、金相顯微鏡,解剖顯微鏡 等,但基本結(jié)構(gòu)仍為光學(xué)和機(jī)械兩個(gè)部分。 單式光學(xué)顯微鏡(通常用的放大鏡、解剖鏡等)光學(xué)結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、放大倍數(shù)小、光行差明顯,不宜進(jìn)行顯微攝影,在這里就不作介紹了。
復(fù)式顯微鏡光學(xué)系統(tǒng)比較完善、機(jī)械裝置比較復(fù)雜,適合于顯微工作的開(kāi)展: 1.顯微鏡的成像
顯微鏡的成象光路:
它通過(guò)目鏡、物鏡等光學(xué)器件構(gòu)成放大光路,而使所得虛像A“B”的距離恰好等于人眼的鳴視距離——250毫米,以獲得將標(biāo)本放大10~200倍的可見(jiàn)影像。
2.光學(xué)顯微鏡的基本結(jié)構(gòu)
光學(xué)顯微鏡的基本構(gòu)造分為兩部分。一部分是光學(xué)系統(tǒng),如接目鏡、接物鏡、聚光器、光源等,另一部分是機(jī)械系統(tǒng),如鏡腳、鏡臂、鏡筒、載物臺(tái)、物鏡轉(zhuǎn)換器、大小螺旋、推進(jìn)器等。 (1)接物鏡
接物鏡是光學(xué)顯微鏡的關(guān)鍵部件,整個(gè)顯微鏡系統(tǒng)的成像質(zhì)量與分辨率都由接物鏡決定。它 由一組精密的透鏡組成,其作用是將檢視標(biāo)本做第一次放大。顯微接物鏡生產(chǎn)時(shí)做過(guò)各種像 差校正,它有一個(gè)光闌——孔徑光闌,可以控制入射光束的直徑,其作用是減小或擴(kuò)大視場(chǎng) 而不改變像的明亮度。 接物鏡有不同倍率其中干燥系用在正常情況下觀察。水浸系或油浸系在觀察時(shí)要 在接物鏡口與標(biāo)本結(jié)合處點(diǎn)水或點(diǎn)油。
由于接物鏡的成像質(zhì)量影響攝影效果和觀察效果,所以接物鏡也是顯微攝影的重要組成部分。
接物鏡有三個(gè)主要參數(shù)——數(shù)值孔徑N·A值、放大率和蓋片厚度。它們都標(biāo)在鏡頭殼上。 ①N·A值
數(shù)值孔徑N·A是標(biāo)志物鏡工作性能的重要參數(shù),它決定了物鏡的分辨率。N·A=n·sinθ 式中n為介質(zhì)折射系數(shù),Q為入射角。 表明了物鏡數(shù)值孔徑與介質(zhì)折射系數(shù)、入射角的關(guān)系。理論上的最大入射角為180°,它的一半(90°)的正弦等于1,而空氣的折射系數(shù)為1.0,水的折射系數(shù)為1.33,松節(jié)油的折射系數(shù)為1.5,所以在同樣入射角情況下液浸物鏡數(shù)值孔徑比干燥物鏡的大,因此分辨能力也大得多。 N·A值越大,分辨率越大,N·A值越小,景深與焦深越長(zhǎng)。
N·A值尚與鏡口角有關(guān),鏡口角越大,進(jìn)光量越大,所視像野中的影像越清楚,分辨率就越 大。反之,分辨率就小以致看不清楚。由于低倍物鏡的鏡口角小于高倍物鏡的鏡口角,所以低倍物鏡的分辨率就不如高倍物鏡的分辨率大。(這是指干燥系而言,油浸系物鏡有介 質(zhì)的折射率,可提高分辨率。 分辨率還受照明強(qiáng)度及光源波長(zhǎng)的影響,在一定范圍內(nèi),照明強(qiáng)度大,分辨力就大。
②放大率
放大率是指檢視的放大倍率(即虛像放大倍率),倍率越大,工作距離越近。對(duì)每個(gè)具體物 鏡來(lái)講,它的放大倍率是不變的,工作距離也是不變的。如果采用10×目鏡、40×物鏡,觀 察時(shí)放大了400倍,但對(duì)顯微攝影來(lái)講,由于要增加目鏡到 感光片的這段距離就不是400倍了,有些顯微攝影的攝影倍率是顯微鏡放大倍率的1/2。
③對(duì)蓋片厚度的要求
顯微鏡對(duì)蓋片的厚度要求為抽筒的1/100,達(dá)0.16~0.17毫米,每差±0.01毫米抽筒則必須相 應(yīng)改動(dòng)10毫米,否則其放大倍率就不是標(biāo)示的倍率了。
油浸鏡是借點(diǎn)油的折射率來(lái)提高視野的亮度和分辨率。點(diǎn)油后使接物鏡 與標(biāo)本構(gòu)成一個(gè)光具組。 常用于油浸鏡的點(diǎn)油及折射率為:
洋杉木油1.51
檀香木油1.51
甘油1.46
蘇合香1.58
折射率越大呈像亮度越強(qiáng),分辨率也就越大。
(2)接目鏡
接目鏡主要有以下兩個(gè)作用一是將物鏡送來(lái)的初級(jí)放大影像再作第二次放大。
二是矯正接物鏡成像中的相差、色差和照度。接目鏡的放大率一般從×4~×25,其鏡筒長(zhǎng)的放大倍率大,反之,放大倍率則小。
眼點(diǎn)是目鏡的一個(gè)主要參數(shù),在顯微攝影中為尤重要。眼點(diǎn)即顯微鏡對(duì)清焦點(diǎn)后在目鏡上形 成的出射點(diǎn)。一般眼點(diǎn)距離目鏡0.5厘米左右,放大倍率越大,這段距離越短,放大倍率越 小,這段距離越長(zhǎng)。目視時(shí),瞳孔恰與此點(diǎn)相接,用帶鏡 頭的照相機(jī)攝影時(shí),鏡頭的前片透鏡表面要與此點(diǎn)相接,用不帶鏡頭的攝影裝置拍攝時(shí),要 從眼點(diǎn)計(jì)算所加近攝裝置(伸縮皮腔形式或近攝接圈)的伸長(zhǎng)尺寸,以計(jì)算實(shí)際倍率。 (3)聚光器
顯微鏡的聚光器有明視野聚光器、暗視野聚光器和特殊用途聚光器(如偏振光、相位差等等)。 ①明視野聚光器
明視野聚光器由集光器、虹彩、濾色鏡環(huán)和反射鏡四個(gè)部分組成。
其中集光鏡由兩個(gè)或兩個(gè)以上透鏡組成,象一個(gè)簡(jiǎn)單的照相機(jī)鏡頭,它的數(shù)值孔徑(N·A) 值為1.20~1.40左右。它的主要作用是提高象野的亮度和提高接物鏡對(duì)標(biāo)本的分辨率。
②虹彩
結(jié)構(gòu)像照相機(jī)的光圈,它不但可以調(diào)節(jié)照明強(qiáng)度,同時(shí)還具有改變分辨率和反差的作用,即:虹彩開(kāi)大,分辨力高,反差弱,虹彩縮小則相反。濾色鏡環(huán)用來(lái)放置濾色片或毛玻璃,可 用來(lái)改變光色或亮度。 反光鏡分為平凹兩面,并要使光束正好對(duì)準(zhǔn)反光鏡中央。 暗視野聚光器通常用于拍攝極微小的物體,如化學(xué)明膠、梅毒螺旋體或明視野看不見(jiàn)、看不 清沒(méi)有染色的標(biāo)本。它也常常用于熒光顯微攝影。使用暗視野聚光器拍攝時(shí)光源亮度要強(qiáng)些,不能使用濾色鏡。為防止外來(lái)光線(xiàn)干擾,暗視野 顯微攝影最好在暗室中進(jìn)行。
3.光學(xué)顯微鏡的主要性能
光學(xué)顯微鏡的主要性能從兩方面體現(xiàn),即放大倍率和分辨率。
(1)放大倍率
理論上講,光學(xué)顯微鏡的放大倍率在鏡筒長(zhǎng)度為16~17厘米時(shí)為物鏡×目鏡倍率,但是我們 要 將實(shí)物看清,不僅僅是要將其放大,更主要的是分辨出它的細(xì)部形態(tài),所以放大倍率要與物 鏡、分辨率同時(shí)考慮。如,同樣是放大200倍的顯微鏡目鏡與物鏡,可以有三種組合方式,4 0×5、20×10、10×20,但是三種組合形式的分辨率、焦點(diǎn)深度與成像面的亮度、拍攝時(shí)需 要使用的快門(mén)速度有很大差別。
物鏡(1) 20×10 (2) 41×5 (3) 10×20
物鏡的數(shù)值孔經(jīng) 分辨能力 焦點(diǎn)深度 焦平面亮度比 照相快門(mén)速度 0.40 0.70μ 1.25μ 1.0 1/30秒 0.65 0.43μ 0.77μ 0.8 1/200秒 0.25 1.1μ 2.0μ 0.4 1/40秒 在顯微攝影中,其放大倍率與出射點(diǎn)至感光片的距離有關(guān),所以顯微攝影的放大 倍率的計(jì)算公式為M=物鏡倍率×目鏡倍率×目鏡出射點(diǎn)至底片的距離/250毫米。這個(gè)公式說(shuō) 明,只有當(dāng)目鏡出射 點(diǎn)至感光片的距離為250毫米時(shí),顯微攝影的放大倍率才等于物鏡倍率×目鏡倍率,若將目 鏡 出射點(diǎn)到感光片的距離加大,其放大倍率也隨著加大,但這只是形態(tài)增大而分辨率不變。將 底片用來(lái)放大照片時(shí)也只是形態(tài)的放大,而不增加分辨率。