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顯微攝影
應(yīng)用于動植物檢疫工作的技術(shù)
顯微攝影是通過顯微鏡來拍攝的方法。在動植物檢疫工作上是科學(xué)研究、經(jīng)驗(yàn)交流、仲裁談判不可缺少的手段之一。要取得良好的顯微攝影效果，最重要的是要有良好的顯微鏡設(shè)備和良好的顯微鏡操作技術(shù)。
基本信息
| 外文名 | Photographic photography |
| 拍攝工具 | 顯微鏡 |
| 方法 |
基本簡介
意大利帕多瓦大學(xué)地質(zhì)學(xué)者伯納多·凱撒晃動濾光器、瞄準(zhǔn)鏡以及不斷變換方向，才拍攝到這張輝長巖的微觀圖片。這些巖石沒有特別的科學(xué)意義，但里面有很多微小的橄欖石，看起來非常美麗。
操作方法
(1) 裝配
Olympus PM-10AD顯微攝影系統(tǒng)的裝配圖。
加選擇135相機(jī)拍攝時，首先應(yīng)將適配器PM-PBS的上部裝上135照相機(jī)，前端裝上聚焦用望遠(yuǎn)鏡PM-VTM。然后在顯微鏡的直筒部分加上適當(dāng)倍數(shù)的NFK攝影目鏡(如3.3x)，并將上述PM-PBS安裝在該目鏡上。最后應(yīng)將PM-PBS與自動曝光控制器PM—CBAD之間的連接線裝好并分別將顯微鏡和PM-CBAD的電源接通，并注意檢查電壓選擇范圍是否與所用電源相匹配。
(3)膠卷的安裝
操作時一般不取下相機(jī)，直接在本裝置上裝片或退片。正確的裝片方法如下：
2)將片頭插入卷片軸縫隙中，注意不要讓片尖從袖縫的另一端伸出。按控制器上的進(jìn)片按鈕(TIME OFF／WINDING)拖片直至使膠片兩端的片孔全部嵌入卷片齒輪中為止。
(5)黑白顯微攝影
先將拍攝標(biāo)本準(zhǔn)確聚焦，并用調(diào)焦望遠(yuǎn)鏡選好待拍標(biāo)本區(qū)。拍攝步驟如下：
1)將“MODE／EXPOSURE TIME”調(diào)至“AUTO”；按下“FORMAT”選擇鍵中的“35”；把“ASA”調(diào)至所用膠片的感光速度ASA值；將“RE-CIPROCITY，調(diào)至膠片的相應(yīng)數(shù)值(可參見控制器底部的塑料說明板，除特殊要求外，通常應(yīng)放在“4”位上)。
2)檢查SAFETY指示燈是否為綠色，若為紅燈應(yīng)作以下檢查：A．若紅燈
采用降低電壓以減小照明亮度的方法。B．若紅燈連續(xù)亮則表明曝光不足，應(yīng)增
加亮度。
3)將“EXPOSURE ADJ”調(diào)至適當(dāng)值。一般用明視野照明而樣品又均勻分布時，應(yīng)調(diào)至(1)；若樣品分布不均勻或用其他方式照明時則應(yīng)進(jìn)行適當(dāng)?shù)恼{(diào)整：
4)拉下控制器上的曝光鈕，“WORK”燈將隨著曝光而開啟，曝光結(jié)束“WORK”燈燈滅，膠片將自動驅(qū)進(jìn)一個片位。
(6)135彩色膠卷顯微攝影
進(jìn)行彩色攝影的基本方法除色溫調(diào)節(jié)外，其余均與黑白顯微攝影相同。下面僅介紹調(diào)溫法；
1)將色溫檢測器PM-CTR安裝么自動曝光器PM-PBS的左側(cè)。
2)將標(biāo)本片聚焦后讓視野移至無樣品的地方。
3)將光路控制拉桿移至最外部(黃色帶)；把色溫調(diào)節(jié)旋至“D”（日光型膠卷)或“T”(燈光型膠卷)。
4)在顯微鏡上加LBT(燈光型膠卷)或LBD-2(日光型膠卷)濾光片，調(diào)節(jié)顯微鏡的亮度使色溫調(diào)節(jié)器上的指示燈亮至A處(黃色)；若A處以上的綠燈亮表明色溫過高；A處以下的紅燈亮?xí)r表明色溫過低。
行顯微攝影。
(7)手動顯微攝影
在持殊情況下常常需要人為地改變曝光條件以求得更好的攝影效果經(jīng)驗(yàn)的操作者也可以選擇手動進(jìn)行顯微攝影，其方法如下：
1)用“MODE／EXP0SURE TIME”鈕自行選擇曝光時間(可從1s-40min)。
2)按快門鈕，這時的快門將按設(shè)定的時間曝光。
3)若需要曝光時間超過40m可將“MODE鈕旋至T再按下快門鈕，快門將一直開啟，直至按動“TIME OFF／WINDING”鈕。
(8)自動曝光鎖定裝置的應(yīng)用
在對同一標(biāo)本片的不同位置或不同成分進(jìn)行攝影時，常常要采用相同的曝光
時間，這時可按下“AE LOCK”鍵。在此后的拍攝中將維持相同的曝光時間，“TIME RECALL”燈將閃亮，直至“AE LOCK”鍵被重新按動后才被解除。
(9)多次重復(fù)曝光：其操作如下：
A．先將“ASA”鈕旋至8倍于膠片ASA值處(如將100ASA膠卷旋至800處)。
B．將“FORMAT”選擇的“L”鍵按下，這時就能對同一底片進(jìn)行多次曝光。
C.結(jié)束后按下“35”鍵和“WINDING鍵，膠片將自動前進(jìn)一個片位。
曝光控制
顯微攝影
在控制曝光時，要注意以下因素：
光源強(qiáng)度的影響：由于電壓的變化，光源亮度可能產(chǎn)生5-10倍的變化。光源的距離及對標(biāo)本的照射面積。光源的波長及色溫。光源的波長長、色溫低，色光偏紅時，曝光時間要長些。光波短，色溫高，色光偏青時，曝光時間要短些。電壓的波動會引起曝光量的改變，所以攝制過程中要保持電壓的相對穩(wěn)定。聚光器的位置經(jīng)過實(shí)驗(yàn)固定后不宜改動。使用濾色鏡、乳白玻璃、偏振鏡等都要按其曝光指數(shù)增加曝光時間（手動曝光）。目鏡的放大倍率。以×5倍的目鏡作曝光基準(zhǔn)1時，×10倍目鏡要4倍的曝光量，×15倍目鏡要增至9倍的曝光。物鏡的倍率和N·A值：如果把×10倍的目鏡作為1時，×40倍目鏡要2.5倍的曝光，×100倍的物鏡要4倍的曝光。從目鏡出射點(diǎn)到感光片的距離 標(biāo)本的染色也會對曝光產(chǎn)生影響 標(biāo)本與目鏡間的介質(zhì)折射率大、曝光時間短，反之，曝光時間長。曝光時間與折射率成反比。聚光鏡的光闌孔徑變化能使曝光產(chǎn)生2～20倍的變化。
反差控制
顯微攝影
標(biāo)本本身對反差的影響 標(biāo)本切片厚會產(chǎn)生光的折反射，同時細(xì)部結(jié)構(gòu)產(chǎn)生重疊。標(biāo)本新鮮、色彩鮮艷反差強(qiáng)。標(biāo)本載物片厚或蓋片厚、有色、有水紋都會降低反差。照明對反差的影響：照明應(yīng)適中，否則會降低反差，太亮?xí)_擊標(biāo)本細(xì)部結(jié)構(gòu)，太暗會使光路中的臟物呈現(xiàn)在影屏上。光束直徑與視場直徑一致時反差強(qiáng)，光束直徑大于視場直徑就會降低反差。集光器與虹彩對反差的影響：集光器過低、虹彩與光欄小，都會降低反差，所以要依具體情況升降集光器或開放虹彩。虹彩光闌的直徑必須與物鏡口徑一致。濾色片對反差的影響：用補(bǔ)色濾色片反差強(qiáng)，用統(tǒng)一色濾色片反差弱。
光學(xué)顯微攝影的反差雖然是大些為好，但也要適當(dāng)處理，不然反差過大就會損失細(xì)部結(jié)構(gòu)，同時也會影響分辨率，同樣不能得到完美的效果。
單式光學(xué)顯微鏡（通常用的放大鏡、解剖鏡等）光學(xué)結(jié)構(gòu)簡單、放大倍數(shù)小、光行差明顯，不宜進(jìn)行顯微攝影，在這里就不作介紹了。
復(fù)式顯微鏡光學(xué)系統(tǒng)比較完善、機(jī)械裝置比較復(fù)雜，適合于顯微工作的開展：
1.顯微鏡的成像
顯微鏡的成象光路：
它通過目鏡、物鏡等光學(xué)器件構(gòu)成放大光路，而使所得虛像A“B”的距離恰好等于人眼的鳴視距離——250毫米，以獲得將標(biāo)本放大10～200倍的可見影像。
2.光學(xué)顯微鏡的基本結(jié)構(gòu)
光學(xué)顯微鏡的基本構(gòu)造分為兩部分。一部分是光學(xué)系統(tǒng)，如接目鏡、接物鏡、聚光器、光源等，另一部分是機(jī)械系統(tǒng)，如鏡腳、鏡臂、鏡筒、載物臺、物鏡轉(zhuǎn)換器、大小螺旋、推進(jìn)器等。
（1）接物鏡
接物鏡是光學(xué)顯微鏡的關(guān)鍵部件，整個顯微鏡系統(tǒng)的成像質(zhì)量與分辨率都由接物鏡決定。它 由一組精密的透鏡組成，其作用是將檢視標(biāo)本做第一次放大。顯微接物鏡生產(chǎn)時做過各種像 差校正，它有一個光闌——孔徑光闌，可以控制入射光束的直徑，其作用是減小或擴(kuò)大視場 而不改變像的明亮度。
接物鏡有不同倍率其中干燥系用在正常情況下觀察。水浸系或油浸系在觀察時要 在接物鏡口與標(biāo)本結(jié)合處點(diǎn)水或點(diǎn)油。
由于接物鏡的成像質(zhì)量影響攝影效果和觀察效果，所以接物鏡也是顯微攝影的重要組成部分。
①N·A值
表明了物鏡數(shù)值孔徑與介質(zhì)折射系數(shù)、入射角的關(guān)系。理論上的最大入射角為180°，它的一半（90°）的正弦等于1，而空氣的折射系數(shù)為1.0，水的折射系數(shù)為1.33，松節(jié)油的折射系數(shù)為1.5，所以在同樣入射角情況下液浸物鏡數(shù)值孔徑比干燥物鏡的大，因此分辨能力也大得多。
N·A值越大，分辨率越大，N·A值越小，景深與焦深越長。
N·A值尚與鏡口角有關(guān)，鏡口角越大，進(jìn)光量越大，所視像野中的影像越清楚，分辨率就越 大。反之，分辨率就小以致看不清楚。由于低倍物鏡的鏡口角小于高倍物鏡的鏡口角，所以低倍物鏡的分辨率就不如高倍物鏡的分辨率大。（這是指干燥系而言，油浸系物鏡有介 質(zhì)的折射率，可提高分辨率。
分辨率還受照明強(qiáng)度及光源波長的影響，在一定范圍內(nèi)，照明強(qiáng)度大，分辨力就大。
②放大率
放大率是指檢視的放大倍率（即虛像放大倍率），倍率越大，工作距離越近。對每個具體物 鏡來講，它的放大倍率是不變的，工作距離也是不變的。如果采用10×目鏡、40×物鏡，觀 察時放大了400倍，但對顯微攝影來講，由于要增加目鏡到 感光片的這段距離就不是400倍了，有些顯微攝影的攝影倍率是顯微鏡放大倍率的1/2。
③對蓋片厚度的要求
顯微鏡對蓋片的厚度要求為抽筒的1/100,達(dá)0.16～0.17毫米，每差±0.01毫米抽筒則必須相 應(yīng)改動10毫米，否則其放大倍率就不是標(biāo)示的倍率了。
常用于油浸鏡的點(diǎn)油及折射率為：
洋杉木油1.51
檀香木油1.51
甘油1.46
樹膠1.52
蘇合香1.58
折射率越大呈像亮度越強(qiáng)，分辨率也就越大。
（2）接目鏡
接目鏡主要有以下兩個作用一是將物鏡送來的初級放大影像再作第二次放大。
二是矯正接物鏡成像中的相差、色差和照度。接目鏡的放大率一般從×4～×25，其鏡筒長的放大倍率大，反之，放大倍率則小。
眼點(diǎn)是目鏡的一個主要參數(shù)，在顯微攝影中為尤重要。眼點(diǎn)即顯微鏡對清焦點(diǎn)后在目鏡上形 成的出射點(diǎn)。一般眼點(diǎn)距離目鏡0.5厘米左右，放大倍率越大，這段距離越短，放大倍率越 小，這段距離越長。目視時，瞳孔恰與此點(diǎn)相接，用帶鏡 頭的照相機(jī)攝影時，鏡頭的前片透鏡表面要與此點(diǎn)相接，用不帶鏡頭的攝影裝置拍攝時，要 從眼點(diǎn)計(jì)算所加近攝裝置（伸縮皮腔形式或近攝接圈）的伸長尺寸，以計(jì)算實(shí)際倍率。
（3）聚光器
①明視野聚光器
明視野聚光器由集光器、虹彩、濾色鏡環(huán)和反射鏡四個部分組成。
其中集光鏡由兩個或兩個以上透鏡組成，象一個簡單的照相機(jī)鏡頭，它的數(shù)值孔徑（N·A) 值為1.20～1.40左右。它的主要作用是提高象野的亮度和提高接物鏡對標(biāo)本的分辨率。
②虹彩
結(jié)構(gòu)像照相機(jī)的光圈，它不但可以調(diào)節(jié)照明強(qiáng)度，同時還具有改變分辨率和反差的作用，即：虹彩開大，分辨力高，反差弱，虹彩縮小則相反。濾色鏡環(huán)用來放置濾色片或毛玻璃，可 用來改變光色或亮度。
反光鏡分為平凹兩面，并要使光束正好對準(zhǔn)反光鏡中央。
③暗視野聚光器的視野背景是暗的，被攝體是發(fā)光的或明亮的。
暗視野聚光器通常用于拍攝極微小的物體，如化學(xué)明膠、梅毒螺旋體或明視野看不見、看不 清沒有染色的標(biāo)本。它也常常用于熒光顯微攝影。使用暗視野聚光器拍攝時光源亮度要強(qiáng)些，不能使用濾色鏡。為防止外來光線干擾，暗視野 顯微攝影最好在暗室中進(jìn)行。
3.光學(xué)顯微鏡的主要性能
光學(xué)顯微鏡的主要性能從兩方面體現(xiàn)，即放大倍率和分辨率。
（1）放大倍率
理論上講，光學(xué)顯微鏡的放大倍率在鏡筒長度為16～17厘米時為物鏡×目鏡倍率，但是我們 要 將實(shí)物看清，不僅僅是要將其放大，更主要的是分辨出它的細(xì)部形態(tài)，所以放大倍率要與物 鏡、分辨率同時考慮。如，同樣是放大200倍的顯微鏡目鏡與物鏡，可以有三種組合方式，4 0×5、20×10、10×20，但是三種組合形式的分辨率、焦點(diǎn)深度與成像面的亮度、拍攝時需 要使用的快門速度有很大差別。
物鏡（1） 20×10 （2） 41×5 （3） 10×20
物鏡的數(shù)值孔經(jīng) 分辨能力 焦點(diǎn)深度 焦平面亮度比 照相快門速度 0.40 0.70μ 1.25μ 1.0 1/30秒 0.65 0.43μ 0.77μ 0.8 1/200秒 0.25 1.1μ 2.0μ 0.4 1/40秒
在顯微攝影中，其放大倍率與出射點(diǎn)至感光片的距離有關(guān)，所以顯微攝影的放大 倍率的計(jì)算公式為M=物鏡倍率×目鏡倍率×目鏡出射點(diǎn)至底片的距離/250毫米。這個公式說 明，只有當(dāng)目鏡出射 點(diǎn)至感光片的距離為250毫米時，顯微攝影的放大倍率才等于物鏡倍率×目鏡倍率，若將目 鏡 出射點(diǎn)到感光片的距離加大，其放大倍率也隨著加大，但這只是形態(tài)增大而分辨率不變。將 底片用來放大照片時也只是形態(tài)的放大，而不增加分辨率。
感光材料
藻類共存
在這張硅藻和紅藻的照片中，有機(jī)體與健康生態(tài)系統(tǒng)之間的聯(lián)系被以微觀形式表現(xiàn)出來，各種生命形態(tài)需要互相依賴才能生存。
實(shí)用顯微攝影的方法主要有三種（注：不包括本實(shí)驗(yàn)所用的相紙感光）：
第一種方法是利用傳統(tǒng)的菲林相機(jī)，讓被攝物體成像于黑白或彩色膠片上，制成負(fù)片，再把它沖印放大成照片（正片），以便觀察研究和永久保存?；蛘咦尡慌臄z物體成像于反轉(zhuǎn)片上，直接制成正片，用于幻燈投影。要求不高時也可直接成像于相紙上，成為一負(fù)片，并不影響相片的分辨率。本物理實(shí)驗(yàn)室為本、?？茖W(xué)生提供這一顯微攝影廣方法。
第二種方法是利用數(shù)碼相機(jī)，通過專用接筒或外接專用鏡頭，把被攝物體成像于數(shù)碼相機(jī)的內(nèi)存中。成為一個壓縮的JPEG文件，傳輸?shù)接?jì)算機(jī)中，再利用圖像顯示軟件把圖像顯示于監(jiān)視器上，或者直接通過打印機(jī)輸出相片來。也可把圖像存貯于媒介上，如軟盤、閃存盤、光盤等，再通過數(shù)碼沖印商店，沖印出數(shù)碼相片。由于目前市場上大多數(shù)數(shù)碼相機(jī)都是不可變換鏡頭的相機(jī)（除了個別昂貴的專用數(shù)碼相機(jī)，如Nikon的Ｄ1型相機(jī)外），所以顯微鏡不設(shè)連接數(shù)碼相機(jī)的卡口，而通過加設(shè)一鏡頭接筒的方法，再連接某些特殊鏡頭結(jié)構(gòu)的數(shù)碼相機(jī)，如本實(shí)驗(yàn)采用的Nikon Coolpix 4500型數(shù)碼相機(jī)。
第三種方法，則是在顯微鏡上加接專用連接鏡頭，接上CCD攝錄鏡頭，再把動態(tài)的圖像傳送到計(jì)算機(jī)，通過軟件在顯示器上表現(xiàn)出動態(tài)圖像來，可把Video圖像存儲成某種格式的文件，如avi、mpeg或mov等。也可把瞬間的影像保存到計(jì)算機(jī)中，成為儲存器上的一靜態(tài)圖像的文件，如bmp、tif或jpg等，與數(shù)碼相機(jī)所獲得的圖像相似。這種方法的優(yōu)點(diǎn)是能夠獲得動態(tài)圖像，在視覺效果上更生動、更勝一籌。不過其靜態(tài)圖像的分辯率一般只能用于電視機(jī)或顯示器上的顯示，并不適合于打印輸出和印刷等領(lǐng)域。
微觀世界
植物生殖器官
這是一張被顯微鏡放大了20倍的雄株芥末類植物的生殖器官，摘走了2009年尼康微觀世界攝影大賽的桂冠。擬南芥是第一種完成全部基因組序列測定的高等植物，也是最常用于科學(xué)研究的植物，但這種植物此前卻從未展示過藝術(shù)美感。
續(xù)斷菊花莖這是一張續(xù)斷菊花莖部的橫截面圖片，續(xù)斷菊是鄉(xiāng)間最常見的一種黃色野花。攝影師格雷德·岡瑟說：“續(xù)斷菊毛狀物的紅帽與綠白相間花莖之間的強(qiáng)烈對比，令我感到戰(zhàn)栗?！边@張圖片是在被放大150倍拍攝的，顯示出自然界的神奇。
光刻膠是工業(yè)生產(chǎn)中常用的感光材料。在200倍顯微鏡下，看起來非常美麗，就像太陽用其龐大熱能溫暖著地球。
卵巢螺旋這是一個發(fā)育中的卵子，在琵琶魚的卵巢中做螺旋式移動。攝影師在卵巢壁上加了顏色，看起來特別明顯。這幅圖既有其藝術(shù)美感，又具有科學(xué)價值，可以證明卵巢和卵子的結(jié)構(gòu)。
可愛的海星這幅圖是一只饑餓的小海星正張開嘴，用透明的管狀肢體抓住微生物吃。這張圖片是在放大40倍情況下拍攝的，小海星剛剛進(jìn)入青年期。顏色對比和管狀肢體的動感是這幅圖入選的主要因素。
魚鱗在參加以色列獸醫(yī)協(xié)會實(shí)踐時，獸醫(yī)哈維·薩爾法拍攝到了一條七彩神仙魚的魚鱗。這幅圖是在20倍顯微鏡下拍攝的，可以看到魚鱗的美麗結(jié)構(gòu)和顏色。
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