病毒概述

腺病毒是無包膜的線性雙鏈DNA病毒，在自然界分布廣泛，至少存在100種以上的血清型。其基因組長約36kb，兩端各有一個(gè)反向末端重復(fù)區(qū)（ITR），ITR內(nèi)側(cè)為病毒包裝信號(hào)?；蚪M上分布著4個(gè)早期轉(zhuǎn)錄元（E1、E2、E3、E4）承擔(dān)調(diào)節(jié)功能，以及一個(gè)晚期轉(zhuǎn)錄元負(fù)責(zé)結(jié)構(gòu)蛋白的編碼。早期基因E2產(chǎn)物是晚期基因表達(dá)的反式因子和復(fù)制必須因子，早期基因E1A、E1B產(chǎn)物還為E2等早期基因表達(dá)所必須。因此，E1區(qū)的缺失可造成病毒在復(fù)制階段的流產(chǎn)。E3為復(fù)制非必須區(qū)，其缺失則可以大大地?cái)U(kuò)大插入容量。腺病毒載體大多以5型（Ad5）、2型（Ad2）為基礎(chǔ)，新增了55型（Ad55），很多研究機(jī)構(gòu)在研究當(dāng)中，55型將比5型流行以及應(yīng)用更具廣泛性。

作用機(jī)制

典型的腺病毒載體系統(tǒng)如：穿梭質(zhì)粒pCA13/腺病毒基因組質(zhì)粒pBHG11/包裝細(xì)胞293細(xì)胞。pCA13/的HCMVIE啟動(dòng)子－多克隆位點(diǎn)－SV40AN（polyA）構(gòu)成外源基因的表達(dá)盒，該表達(dá)盒的插入使腺病毒E1基因缺失，但是保留其兩端側(cè)翼序列（左側(cè)的1~3bp的ITR，右側(cè)從3.5kb到末端的維持病毒裝配和活力必須的蛋白IX的基因），也保留了腺病毒的包裝信號(hào)φ（194~358bp）；pBHG11則保留了腺病毒基因組的絕大部分，但是缺失了包裝信號(hào)φ、0.5~3.7圖距（mu）部分的E1區(qū)、77.5～86.2mu的E3區(qū)，293細(xì)胞是整合有Ad5E1基因的人胚腎細(xì)胞系。pBHG11因?yàn)槿笔Оb信號(hào)及E1區(qū)而不能復(fù)制，pCA13帶有包裝信號(hào)及E1的側(cè)翼序列，但是缺失E1區(qū)及腺病毒絕大部分基因組，同樣不能復(fù)制。外源目的基因插入pCA13后，與pBHG11共轉(zhuǎn)染，進(jìn)入293細(xì)胞。pCA13與pBHG11在細(xì)胞內(nèi)發(fā)生同源重組，同時(shí)，293細(xì)胞提供E1蛋白，從而包裝產(chǎn)生腺病毒顆粒。該病毒的蛋白質(zhì)外殼同野生型腺病毒相似，具有同樣的感染力進(jìn)入靶細(xì)胞的能力，但是基因組DNA的E1區(qū)被外源目的基因取代，即進(jìn)入靶細(xì)胞后病毒不能復(fù)制，但可以表達(dá)目的蛋白。

分類

第一代腺病毒載體：一般將E1或E3基因缺失的腺病毒載體稱為第一代腺病毒載體，此類型載體在未經(jīng)過純化時(shí)可引發(fā)機(jī)體產(chǎn)生較強(qiáng)的炎癥反應(yīng)和免疫反應(yīng)，純化后可以安全使用，體內(nèi)表達(dá)周期可達(dá)4周。

第二代腺病毒載體：E2A或E4基因缺失的腺病毒載體被稱為第二代腺病毒載體，產(chǎn)生的免疫反應(yīng)較弱其載體容量和安全性方面有所改進(jìn)，但病毒包裝難度和出毒和病毒滴度下降厲害，目前應(yīng)用相當(dāng)局限。

第三代腺病毒載體：第三代載體缺失了全部的（無病毒載體，gutlessvector）或大部分腺病毒基因（微型腺病毒載體，miniAd），僅可保留ITR和包裝信號(hào)序列。第三代腺病毒載體最大可插入35kb的基因，病毒蛋白表達(dá)引起的細(xì)胞免疫反應(yīng)進(jìn)一步減少，載體中引入核基質(zhì)附著區(qū)基因可使得外源基因保持長期表達(dá)，并增加了載體的穩(wěn)定性。這一載體系統(tǒng)需要一個(gè)腺病毒突變體作為輔助病毒。

目前，第一代腺病毒載體仍是科研和臨床應(yīng)用最為廣泛的腺病毒載體。一般常用Ad5型腺病毒。

腺病毒載體系統(tǒng)

目前，最主流的腺病毒載體系統(tǒng)有Adeasy系統(tǒng)和AdMax系統(tǒng)。

Adeasy系統(tǒng)：通過原核重組極大提高了腺病毒的重組效率。其具體的構(gòu)建步驟如下圖。

AdMax系統(tǒng)：Cre/LoxP體系改造后的真核腺病毒包裝體系，進(jìn)一步增加的操作的便捷，同時(shí)滴度較Adeasy有進(jìn)一步提高。步驟如圖所示。

下面是一些經(jīng)典的AdMax系統(tǒng)質(zhì)粒圖譜：

應(yīng)用優(yōu)勢(shì)

腺病毒載體轉(zhuǎn)基因效率高，體外實(shí)驗(yàn)通常接近100%的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率；可轉(zhuǎn)導(dǎo)不同類型的人組織細(xì)胞，不受靶細(xì)胞是否為分裂細(xì)胞所限；容易制得高滴度病毒載體，在細(xì)胞培養(yǎng)物中重組病毒滴度可達(dá)（10E+11）/ml；進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)并不整合到宿主細(xì)胞基因組，僅瞬間表達(dá)，安全性高。因而，腺病毒載體在基因治療臨床試驗(yàn)方面有了越來越多的應(yīng)用，成為繼逆轉(zhuǎn)錄病毒載體之后廣泛應(yīng)用且最具前景的病毒載體。