雜交瘤技術(shù)的基本原理

一單克隆抗體的制備

1975年kǒhler和milstein首先報道用細胞雜交技術(shù)使經(jīng)綿羊紅細胞（srbc)免疫的小鼠脾細胞與骨髓瘤細胞融合，建立起第一個b細胞雜交瘤細胞株，并成功地制得抗srbc的單克隆抗體（monlclonalantibody,MCAB）。迄今世界已研制成數(shù)以千計的mcab。

單克隆抗體的理化性狀高度均一，生物活性單一，與抗原結(jié)合的特異性強，便于人為處理和質(zhì)量控制，并且來源容易，所以一問世便受到歡迎和重視。在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中，mcab在診斷疾病、判斷預(yù)后、防治疾病以及疾病機制研究等方面起著巨大的促進作用。為此，兩位發(fā)明者于1984年獲得諾貝爾醫(yī)學(xué)獎。

第一節(jié)雜交瘤技術(shù)的基本原理

雜交瘤抗體技術(shù)的基本原理是通過融合兩種細胞而同時保持兩者的主要特征。這兩種細胞分別是經(jīng)抗原免疫的小鼠細胞作小鼠骨髓瘤細胞。脾淋巴細胞的主要特征是它的抗體分泌功能和能夠在選擇培養(yǎng)基中生長（選擇原理后見），小鼠骨髓瘤細胞則可在培養(yǎng)條件下無限分裂、增殖，即所謂永生性。在選擇培養(yǎng)基的作用下，只有b細胞與骨髓瘤細胞融合的雜交才具有持續(xù)增殖的能力，形成同時具備抗體分泌功能和保持細胞永生性兩種特征的細胞克隆。其原理從下列幾個主要步驟闡明。

（一）細胞的選擇與融合

建立雜交瘤技術(shù)的是制備對抗原特異的單克隆抗體，所以融合細胞一方必須選擇經(jīng)過抗原免疫的b細胞，通常來源于免疫動物的碑細胞。脾是b細胞聚集的重要場所，無論以何種免疫方式刺激，脾內(nèi)皆會出現(xiàn)明顯的抗體應(yīng)答反應(yīng)。融合細胞的另一方則是為了保持細胞融合后細胞的不斷增殖，只有腫瘤細胞才具備這種特性。選擇同一體系的細胞可增加融合的成功率。多發(fā)性骨髓瘤是b細胞系惡性腫瘤，所以是理想的脾細胞融合伴侶。目前常用的b細胞瘤株有：p3-x63-ag8(kǒhlerandmilstein，1975)，p3-nsi/1-ag4-1(kǒhlerandmilstein，1976)，x63-ag8.563(kearneyetal，1979)，sp2/0-ag14(schulmanetal，1978)等，這些細胞株皆為hat敏感細胞株。

使用細胞融合劑造成細胞膜一定程度的損傷，使細胞易于相互粘連而融合在一起。最佳的融合效果應(yīng)是最低程度的細胞損傷而又產(chǎn)生最高頻率的融合。聚乙二醇（peg1000～2000）是目前最常用的細胞融合劑，一般應(yīng)用濃度為40％（w/v）。

（二）選擇培養(yǎng)基的應(yīng)用

細胞融合是一個隨機的物理過程。在小鼠脾細胞和小鼠骨髓瘤細胞混合細胞懸中，經(jīng)融合后細胞將以多種形式出現(xiàn)。如融合的脾細胞和瘤細胞、融合的脾細胞和脾細胞、融合的瘤細胞和瘤細胞、未融合的脾細胞、未融合的瘤細胞以及細胞的多聚體形式等。正常的脾細胞在培養(yǎng)基中存活僅5～7天，無需特別篩選，細胞的多聚體形式也容易死去。而未融合的瘤細胞則需進行特別的篩選去除。

細胞dna合成一般有兩條途徑。主途徑是由糖和氨基酸合成核苷酸，進而合成dna，葉酸作為重要的輔酶參與這一合成過程。另一輔助途徑是在次黃嘌呤和胸腺嘧啶核苷存在的情況下，經(jīng)次黃嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)化酶（hgprt）和胸腺嘧啶核苷激酶（tk）的催化作用合成dna。細胞融合的選擇培養(yǎng)基中有三種關(guān)鍵成分：次黃嘌呤（hypoxanthine，h）、氨甲蝶呤（aminopterin，a）和胸腺嘧啶核苷（thymidine，t），所以取三者的字頭稱為HAT培養(yǎng)基。氨甲蝶呤是葉酸的拮抗劑，可阻斷瘤細胞利用正常途徑合成dna，而融合所用的瘤細胞是經(jīng)毒性培養(yǎng)基選出的hgprt－細胞株，所以不能在該培養(yǎng)基中生長。只有融合細胞具有親代雙方的遺傳性能，可在hat培養(yǎng)基中長期存活與繁殖（圖11-1）。

（三）有限稀釋與抗原特異性選擇

在動物免疫中，應(yīng)選用高純度抗原。

一種抗原往往有多個決定簇，一個動物體在受到抗原刺激后產(chǎn)生的體液免疫應(yīng)答，實質(zhì)是眾多b細胞群的抗體分泌。而針對目標抗原表位的b細胞只占極少部分。由于細胞融合是一個隨機的過程，在已經(jīng)融合的細胞中，有相當(dāng)比例的無關(guān)細胞的融合體，需細篩選去除。

篩選過程一般分為兩步進行：一是融合細胞的抗體篩選，二是在此基礎(chǔ)上進行的特異性抗體篩選。將融合的細胞進行充分稀釋，使分配到培養(yǎng)板的每一孔中的細胞數(shù)在0至數(shù)個細胞之間（30％的孔為0才能保證每個孔中是單個細胞），培養(yǎng)后取上清以elisa法選出抗體高分泌性的細胞；這一過程常被習(xí)慣地稱作克隆化。將這些陽性細胞再進行克隆化，應(yīng)用特異性抗原包被的elisa找出針對目標抗原的抗體陽性細胞株，增殖后進行凍存、體外培養(yǎng)或動物腹腔接種培養(yǎng)。