學(xué)科介紹

體內(nèi)藥物濃度，尤其是血漿（或血清）藥物濃度直接與藥效相關(guān)，并受多種因素影響。例如，不同給藥途徑（如口服、吸人、靜脈注射、肌肉注射、透皮等）可直接影響藥物的吸收、分布、代謝和排泄，從而影響體內(nèi)藥物的濃度以及經(jīng)時行為，并最終影響療效?；颊叩纳硪蛩兀ㄐ詣e、年齡等），病理狀態(tài)（疾病的類型和程度），基因類型，吸收、代謝及分泌排泄功能，都影響藥物在體內(nèi)的經(jīng)時行為。許多藥物需經(jīng)肝臟代謝或經(jīng)腎臟排泄，所以對于肝或腎病患者，由于他們的肝臟生物轉(zhuǎn)化及代謝功能降低、或腎臟的分泌排泄功能降低，往往會造成藥物在體內(nèi)蓄積，進而發(fā)生藥物毒性反應(yīng)。

隨著現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的不斷進步，人們對醫(yī)療質(zhì)量也提出了更高的要求。治療藥物監(jiān)測（Therapeutic Drug Monitoring，TDM）就是以靈敏可靠的方法，檢測病人在給藥后的血液或其他體液中的藥物濃度，并應(yīng)用藥物代謝動力學(xué)理論，指導(dǎo)最適個體化用藥方案的制定和調(diào)整，以避免用藥劑量過大及可能產(chǎn)生的毒性反應(yīng)，保證藥物治療的有效性和安全性。

體內(nèi)藥物分析的特點是樣品成分復(fù)雜，被測組分含量低。

體內(nèi)藥物分析學(xué)科發(fā)展的最大推動力來自于生物醫(yī)學(xué)及新藥藥物動力學(xué)研究領(lǐng)域巨大的要求和分析技術(shù)上的飛躍性進步。與藥代動力學(xué)、臨床藥理學(xué)和生物藥劑學(xué)等學(xué)科互相關(guān)聯(lián)、密不可分。

分析方法

包括比色法(colorimetry)、紫外分光光度法（UV ）和熒光分析法（Fluor ）。光譜法雖然儀器簡單、測定快速，但選擇性和靈敏度都較低，本法不具備分離功能，受結(jié)構(gòu)相近的其他藥物、代謝產(chǎn)物和內(nèi)源性雜質(zhì)的干擾，因此用光譜法分析體液樣品時，除少數(shù)樣品外，一般都需經(jīng)過組分分離、純化等預(yù)處理過程。光譜法的靈敏度低，不適用于測定藥物濃度低的生物樣品。

包括高效液相色譜法（HPLC ）、氣相色譜法（GC ）及其與質(zhì)譜（Ms ）聯(lián)用（HPLC 一MS , GC 一MS ）的方法，以及毛細(xì)管電泳色譜法( HPCE ）。

色譜法具有對組分進行分離和分析的雙重作用，能排除與藥物結(jié)構(gòu)相近的代謝產(chǎn)物和某些內(nèi)源性雜質(zhì)的干擾，具有很高的選擇性和較高的檢測靈敏度，常作為評價其他方法的參比方法。在某些情況下色譜法應(yīng)用也受到一定限制，如HPLC 大多數(shù)儀器配備的是紫外和熒光檢測器，只限于測定具紫外吸收或產(chǎn)生熒光的組分，雖然對某些組分可通過衍生化方法使之具備紫外吸收或熒光性質(zhì)，這勢必增加測定時的操作步驟。又如用GC 法測定生物樣品時，還受被測組分的揮發(fā)性和熱穩(wěn)定性的限制。此外，對于測定濃度很低的樣品（如地高辛有效血藥濃度僅0 . 9 一2 . 2 拌g / L ）時，色譜法的靈敏度難以達(dá)到要求。

包括放射免疫分析法（RIA ）、酶免疫分析法（EIA ）和熒光免疫分析法（EIA ）。

免疫分析是利用半抗原藥物與標(biāo)記藥物競爭抗體結(jié)合原理的一種分析方法，具有快速、簡便和靈敏度高的特點，尤其適用于分析低藥物濃度的體液樣品及大量又需長期分析（如常規(guī)監(jiān)測）的樣品。該法可直接測定體液樣品，并且耗費樣品量少。免疫分析法建立時，需針對每一種藥物制備特異性的抗體和標(biāo)記藥物，費時、費力，在一般實驗室中難于辦到。目前通常采用試劑盒（又稱藥盒），但測定的藥物品種受試劑盒供應(yīng)的限制。

藥物它們主要應(yīng)用于放射免疫分析法（RIA） 、同位素逆稀釋分析，或作為GC - MS 分析中的內(nèi)標(biāo)，以及在藥物分離中作示蹤應(yīng)用等。

利用抗生素在瓊脂培養(yǎng)基內(nèi)的擴散作用，比較樣品與藥物標(biāo)準(zhǔn)品兩者對接種的試驗菌產(chǎn)生的抑菌圈的大小，借以測定樣品內(nèi)抗生素的濃度。

樣品種類

體內(nèi)樣品包括各種體液和組織。但是，在體內(nèi)藥物分析中最為常用的樣本是血液，它能夠較為準(zhǔn)確地反映藥物在體內(nèi)的狀況。尿液中常含有豐富的藥物代謝物，也被較多地使用。唾液因采集便利，且有時與血漿游離藥物濃度具有相關(guān)性而時有使用。而臟器組織，除非特別需要，在臨床治療藥物監(jiān)測中很少使用。

體內(nèi)樣品的采集時間對測定結(jié)果的臨床價值影響很大，是開展臨床治療藥物監(jiān)測必須考慮的基本問題。采集時間應(yīng)在藥代動力學(xué)理論的指導(dǎo)下，根據(jù)臨床治療藥物監(jiān)測的不同目的確定。

用藥方案的確定和調(diào)整是開展臨床治療藥物監(jiān)測的主要工作。應(yīng)該在用藥達(dá)到穩(wěn)態(tài)后再采樣，以保證穩(wěn)態(tài)血藥濃度是否維持在治療濃度范圍內(nèi)，以鞏固療效或控制癥狀的發(fā)作。

對于用藥已達(dá)療效、但需了解長期用藥是否會致慢性毒性時，也需要進行臨床治療藥物監(jiān)測。取樣宜在達(dá)穩(wěn)態(tài)后的血藥峰濃度時間點進行，以確定穩(wěn)態(tài)峰濃度是否接近或超過中毒濃度，以便做出相應(yīng)處理。

急性藥物中毒診斷時，應(yīng)立即取樣測定。治療效果監(jiān)測則可根據(jù)臨床需要確定取樣時間，監(jiān)測劇藥效果。

臨床藥代動力學(xué)及藥效學(xué)研究時，大都采集給藥前及給藥后，藥物及其代謝產(chǎn)物在體內(nèi)的吸收、分布、代謝和消除排泄各階段多個時間點的樣本，以便獲得完整的經(jīng)時行為，為臨床用藥提供參考。

血液樣品

1.血樣（全血）的采集

動物實驗時，可直接從動脈或心臟取血。對于患者或志愿者，通常采集靜脈血，有時根據(jù)血藥濃度和分析方法的靈敏度，也可用毛細(xì)管采血。血樣的采集時間由測定目的和藥代動力學(xué)參數(shù)決定。全血采集后置含有抗凝劑（例如：肝素、EDTA、草酸鹽、枸櫞酸鹽等，防止凝血后影響測定）的試管中，混合均勻，即得。血漿或血清由采集的全血制備。

2.血漿的制備

將采集的全血置含有抗凝劑的試管中，混勻后，以約1000×g力離心5～10分鐘，促進血紅細(xì)胞沉降分離，分取上清液即為血漿。

3.血清的制備

將采集的全血在室溫下放置至少0.5～1小時，待血液凝固后，再以約600×g力離心5～10分鐘，促進血細(xì)胞沉降分離，分取上清液即為血清。

因為藥物與血漿纖維蛋白幾乎不結(jié)合，所以，血漿與血清中藥物的濃度通常相同。血漿比血清分離快、制取量多（約為全血的50%），因而較血清更為常用。如果抗凝劑對藥物可能發(fā)生作用，并對藥物濃度測定產(chǎn)生干擾，則以血清為檢測標(biāo)本。

血樣采集后應(yīng)及時分離血漿或血清，并最好立即進行分析。如不能立即進行測定，應(yīng)根據(jù)藥物在血樣中的穩(wěn)定性及時處置，置于具塞硬質(zhì)玻璃試管或聚塑管（Eppendorf）中密塞保存。短期保存時可置冰箱冷藏（4℃），長期保存時需在-20℃或-80℃下冷凍貯藏，以保障樣本不變質(zhì)和藥物穩(wěn)定，保障監(jiān)測濃度的準(zhǔn)確。因冰凍有時可引起細(xì)胞溶解，妨礙血漿或血清的分離；或因溶血影響藥物濃度變化；所以全血未經(jīng)分離時，不宜直接冷凍保存。

如果待測藥物在樣本中易受酶或酸堿等的作用發(fā)生進一步變化，則須根據(jù)其自身性質(zhì)選擇合適的方法進一步處置。通常的處置方法包括低溫冷凍、調(diào)節(jié)酸堿度、加酶抑制劑等。

尿液樣品

體內(nèi)藥物清除主要是通過腎臟排泄，經(jīng)尿液排出。采集的尿液應(yīng)該是自然排尿。尿液在放置時可因細(xì)菌繁殖而變混濁，因此，尿液采集后應(yīng)立即測定。若不能立即測定（如需收集24小時的尿液），必須采集后立即處置、或低溫保存、或加入防腐劑后冷藏保存。常用的防腐劑有二甲苯、三氯甲烷、醋酸或鹽酸等。二甲苯等有機溶劑可以在尿液的表面形成薄膜，醋酸等可以改變尿液的酸堿性，以抑制細(xì)菌的繁殖。保存時間在36小時以內(nèi)，可置冰箱冷藏；若需長時間保存，則應(yīng)冰凍貯藏。

藥物可以原型（母體藥物）或代謝物及其綴合物（conjugates）等形式排出。尿液中藥物濃度大都較高，采集方便、且采集量大，但尿液濃度通常變化較大。所以，尿液藥物濃度測定的目的通常與血液或唾液樣品的不同，主要用于藥物尿液累積排泄量、尿清除率或生物利用度的研究，以及藥物代謝物及其代謝途徑、類型和速率等的研究。在臨床上，亦可推斷患者是否違反醫(yī)囑用藥。

尿液中藥物濃度的改變不能直接反映血藥濃度，即與血藥濃度相關(guān)性差。受試者的腎功能正常與否直接影響其對藥物的排泄能力，因而，尿液樣品的采集和測定應(yīng)當(dāng)與腎功能指標(biāo)進行關(guān)聯(lián)分析。嬰兒的排尿時間難于掌握，且尿液不易采集完全。

測定尿液中藥物濃度時應(yīng)采用時間尿（一定時間區(qū)間的尿液）。測定尿液中藥物的總量時，應(yīng)收集用藥后一定時間內(nèi)（如24小時，或至基本完全排泄的其他時間）各時間段排泄的全部尿液，記錄體積后，量取一部分用于藥物濃度的測定，再乘以尿液量，計算即可求得尿藥排泄總量。

唾液是由腮腺、頜下腺、舌下腺和口腔黏膜腺體分泌的黏液在V1腔里混合而成的消化液。一般成人每天分泌約1～1.5L.口腔黏膜受到機械或化學(xué)刺激時，各唾液腺的分泌會受到影響，造成唾液組成發(fā)生較大的變化；感官刺激所產(chǎn)生的條件反射以及思維、情緒也會影響唾液腺的分泌；隨年齡不同，唾液的分泌量也不同：小兒的唾液分泌量多，老年人的分泌量減少。通常得到的唾液含有黏蛋白，其黏度是水的1.9倍。唾液的pH值受分泌量變化的影響，分泌量增加時趨向堿性而接近血液的pH值，其波動范圍為6.2～7.6.

唾液的采集應(yīng)盡可能在安靜狀態(tài)下進行。一般在漱口后15分鐘收集，1分鐘內(nèi)大約可采集1ml.唾液采集后應(yīng)立即測量其除去泡沫部分的體積，并以1000×g力離心10分鐘，分取上清液作為藥物濃度測定的樣品。

若分泌量少，可轉(zhuǎn)動舌尖促進唾液的分泌；也可采用物理的（如嚼石蠟塊）或化學(xué)的（如維生素C、酒石酸）等方法刺激，使在短時間內(nèi)獲得大量的唾液。但經(jīng)刺激后唾液中的藥物濃度往往會受到影響。特殊需要時，可采集腮腺、頜下腺及舌下腺分泌的單一唾液。這種單一唾液的采集必須采用特殊唾液采集器收集。

唾液采集后，應(yīng)在4℃以下保存。若分析時無影響，則可用堿處理唾液，以使黏蛋白溶解而降低其黏度。冷凍保存的唾液在解凍后應(yīng)充分?jǐn)噭蚝笤偈褂?，以避免因濃度不均勻而產(chǎn)生測定誤差。

樣品處理

治療藥物監(jiān)測中，除少數(shù)方法可以對采集的樣品直接進行分析外，大多需要對樣品進行必要的預(yù)處理。預(yù)處理的目的是在不破壞待測定成分的前提下，用適當(dāng)?shù)姆椒ǚ蛛x純化或濃縮待測藥物，以減少干擾、提高檢測靈敏度和特異性、降低對儀器的污染和損害。所以，體內(nèi)樣品的預(yù)處理是體內(nèi)樣品分析的重要環(huán)節(jié)。

體內(nèi)樣品的預(yù)處理方法的選擇需要綜合考慮多種因素，包括體內(nèi)樣品的種類、被測藥物的性質(zhì)和濃度、以及所采用的測定方法等三方面。

如血漿或血清需除蛋白，使藥物從蛋白結(jié)合物中釋出；尿液樣品則常采用酸或酶水解使藥物從綴合物中釋出；唾液樣品主要采用離心去除黏蛋白沉淀。

被測定藥物的結(jié)構(gòu)、性質(zhì)、存在形式與濃度范圍等，均直接影響到樣品前處理方法的選擇與應(yīng)用。例如，藥物的酸堿性（pKa）與溶解性影響到藥物的萃取分離條件的選擇，藥物的極性、穩(wěn)定性、官能團性質(zhì)和光譜特性影響到其色譜測定條件的優(yōu)化選擇。不同藥物在樣品中的濃度相差懸殊，濃度大的樣品對前處理要求稍低，濃度越低則樣品前處理要求越高。

體內(nèi)樣品前處理的方法以及分離純化的程度，均取決于測定要求和所采用的測定方法。測定方法的耐受污染程度和抗干擾能力越強、專屬性越好、靈敏度越高，則對前處理的要求越低。通常，免疫測定法由于具有較高的靈敏度和抗干擾能力，體內(nèi)樣品只需經(jīng)離心分離即可直接用于測定。而高效液相色譜和色譜-質(zhì)譜聯(lián)用等方法，為防止蛋白質(zhì)等在色譜柱上沉積、內(nèi)源性干擾、或基質(zhì)效應(yīng)影響，色譜分析前均需對體內(nèi)樣品進行去除蛋白、溶劑萃取、甚至制備衍生物等前處理。

1.去除蛋白質(zhì)法

在測定血樣及組織勻漿等樣品中的藥物時，首先應(yīng)去除蛋白質(zhì)。去除蛋白質(zhì)既可使蛋白結(jié)合型的藥物釋放出來以便測定藥物的總濃度，又可避免進一步的溶劑萃取過程中乳化的形成，并可消除內(nèi)源性干擾，同時保護儀器性能（如保護HPLC柱不被蛋白污染），延長使用壽命。去除蛋白質(zhì)常用的方法包括蛋白沉淀法和蛋白分解法。

2.綴合物水解法

藥物在體內(nèi)經(jīng)二相代謝可以形成葡糖醛酸苷或硫酸酯綴合物，并經(jīng)尿液或膽汁排泄。為了準(zhǔn)確測定體內(nèi)樣品中藥物的含量，首先需將綴合物水解釋放出綴合的藥物或其代謝物后，再進行進一步的處理測定。常用的綴合物水解方法包括酸水解和酶水解。

酸水解通常使用無機酸，如鹽酸或磷酸溶液等。酸的濃度、水解時間和溫度等條件，應(yīng)根據(jù)具體藥物進行優(yōu)化確定。酸水解的優(yōu)點是簡便、快速，但是專屬性較差，并需注意避免藥物的進-步降解。對于遇酸及受熱不穩(wěn)定的藥物，可采用酶水解法。

酶水解法常用葡糖醛酸苷酶或硫酸酯酶，或二者的混合物。酶解時應(yīng)當(dāng)注意控制反應(yīng)的pH、酶試劑用量、孵育溫度、酶解時間，并在厭氧條件下進行。尿液樣本進行酶解時，需要首先隱蔽會抑制酶活力的陽離子。

雖然酶水解法存在水解時間長、酶試劑帶人的黏液蛋白可能導(dǎo)致乳化及色譜柱污染等缺點，但酶水解法具有較高的選擇性，很少使被測藥物或共存物發(fā)生降解，所以常被優(yōu)先選用。

3.分離純化與濃集法

對于濃度較高的樣品，或檢測方法具有足夠靈敏度時，體內(nèi)樣品在經(jīng)去除蛋白質(zhì)或綴合物水解等前處理步驟后即可直接用于測定。但當(dāng)藥物濃度較低或分析方法的特異性或靈敏度不夠高時，體內(nèi)樣品需進行分離、純化與濃集處理，或在去除蛋白質(zhì)或綴合物水解的基礎(chǔ)上進一步進行處理。

萃取法是應(yīng)用最多的分離、純化方法。萃取的目的是為了從大量共存的內(nèi)源性物質(zhì)中分離出所需要的微量組分一藥物及其代謝物，并通過溶劑的蒸發(fā)使樣品得到濃集，殘留物采用適宜的溶劑復(fù)溶后再進行分析測定。萃取法包括液-液萃取法和液-固萃取法。

4.化學(xué)衍生化法

治療藥物監(jiān)測的體內(nèi)樣品色譜分析時，可根據(jù)待測物的化學(xué)結(jié)構(gòu)和檢測方法的要求，通過化學(xué)衍生化方法，特異性地引入功能基團后再進行分析。通常對藥物分子中含有活潑H的極性基團，如含-COOH、-0H、-NH2、-NH-和-SH等，進行化學(xué)衍生化?；瘜W(xué)衍生化的目的包括：改變待測藥物的色譜行為；增強藥物的穩(wěn)定性；改善（手性拆分）分離能力；提高檢測靈敏度等。

GC分析中常對待測物進行硅烷化（silylation）、?；?a class="dict" href="/know/2819765/">acylation）、烷基化（alkylation）或酯化（esterification）等。硅烷化應(yīng)用最廣泛。硅烷化試劑有：三甲基氯硅烷（TMCS）、雙-三甲基硅烷乙酰胺（BSA）、雙-三甲基硅烷三氟乙酰胺（BSTFA）、三甲基硅烷咪唑（TMTS）等。?；噭┯校阂宜狒⒈狒?、五氟苯甲酸酐等。烷基化及酯化試劑有：五氟碘乙烷、重氮甲烷、對溴芐基溴、三氟化硼-甲醇等。

化學(xué)衍生化HPLC分析包括柱前和柱后衍生化兩種方法。柱前衍生化分析中，衍生化胺、氨基酸和氨基醇類化合物的試劑有：丹酰氯、熒光胺、9-芴甲氧羰酰氯、鄰苯二醛等；衍生化羰基化合物的試劑有：2，4-二硝基苯肼、丹酰肼等；衍生化羧酸常用的試劑為2，4'-二溴苯乙酮；衍生化醇類化合物常用的試劑為3，5-二硝基苯甲酰氯、五氟苯甲酰氯等。

由于柱前衍生化法是在分離前使藥物與衍生化試劑反應(yīng)。故與藥物具有相同官能團的干擾物質(zhì)也同樣會生成衍生物，并有可能妨礙藥物的檢測。如果干擾物質(zhì)含量高時，甚至?xí)绊懘郎y成分的衍生化效率。因此，應(yīng)盡可能將樣品進行分離純化后再衍生化。

柱后衍生化是藥物經(jīng)色譜分離后在流出液中進行衍生化，以形成對檢測器具有高靈敏度響應(yīng)的衍生物，從而提高檢測靈敏度。如氨基酸分析儀中的柱后茚三酮衍生化。

具有光學(xué)異構(gòu)體的藥物，由于R（-）與S（+）構(gòu)型的不同，使之具有不同的藥效和藥動學(xué)特性。因此，異構(gòu)體的分離檢測十分重要。光學(xué)異構(gòu)體的分離可采用不對稱試劑衍生化，使其生成非對映異構(gòu)體衍生物，再進行色譜分離測定。常用的不對稱衍生化試劑有：（-）-1-（9-芴基）乙基氧甲酰氯、（+）-樟腦磺酰氯、2，3，4，6-四-O-苯甲酰-β-D-葡萄吡喃糖基異硫氰酸酯、（R）-（+）-1-（1-萘基）乙胺等。

樣品測定

體內(nèi)樣品分析常用的方法有免疫分析法和色譜分析法。

免疫分析法是基于抗體與抗原或半抗原之間的高選擇性反應(yīng)而建立起來的一種生物化學(xué)分析法。具有很高的選擇性和很低的檢出限，可以應(yīng)用于測定各種抗原、半抗原或抗體。免疫分析法分為熒光免疫法、發(fā)光免疫法、酶免疫法及電化學(xué)免疫法等非放射免疫法和放射免疫法，測定的量可以達(dá)到μg甚至ng的水平。這些分析方法多配有專用設(shè)備和試劑，操作相對簡便，適合常規(guī)實驗室使用，多應(yīng)用臨床治療藥物監(jiān)測。

色譜分析包括：氣相色譜（GC）、高效液相色譜（HPLC）和色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（GC-MS、LC-MS）等，這些方法適用于復(fù)雜樣品中微量藥物的專屬準(zhǔn)確定量，多用于藥代動力學(xué)研究。

由于體內(nèi)樣品取樣量少、藥物濃度低、內(nèi)源性物質(zhì)的干擾（如無機鹽、脂質(zhì)、蛋白質(zhì)、代謝物）及個體差異等多種因素影響體內(nèi)樣品測定，為了保證方法的可靠性，必須在建立體內(nèi)樣品分析方法的同時對方法進行驗證。

（一）特異性

必須證明所測定的物質(zhì)是原形藥物或特定的活性代謝物，內(nèi)源性物質(zhì)和相應(yīng)的代謝物及同時服用的其他藥物不得干擾樣品的測定。對于色譜法至少要提供6個不同來源的空白體內(nèi)樣品色譜圖、空白體內(nèi)樣品外加標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)色譜圖（注明濃度）及用藥后的體內(nèi)樣品色譜圖。

（二）標(biāo)準(zhǔn)曲線與線性范圍

根據(jù)所測定物質(zhì)的濃度與響應(yīng)的相關(guān)性，用回歸分析方法獲得標(biāo)準(zhǔn)曲線。標(biāo)準(zhǔn)曲線的高低濃度范圍為線性范圍，在線性范圍內(nèi)濃度測定結(jié)果應(yīng)達(dá)到試驗要求的精密度和準(zhǔn)確度。

必須用至少6個濃度建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，應(yīng)使用與待測樣品相同的生物介質(zhì)，線性范圍要能覆蓋全部待測濃度，不允許將線性范圍外推求算未知樣品的濃度。建立標(biāo)準(zhǔn)曲線時應(yīng)隨行空白體內(nèi)樣品，但標(biāo)準(zhǔn)曲線不包括零點。

標(biāo)準(zhǔn)曲線上各濃度點的實測值與標(biāo)示值的偏差（bias）在可接受范圍內(nèi)時，可判定標(biāo)準(zhǔn)曲線合格。偏差可按下式計算：

式中，回歸值系將各濃度點的響應(yīng)值代人標(biāo)準(zhǔn)曲線計算所得的濃度值；標(biāo)示值系指制備標(biāo)準(zhǔn)曲線時，各相應(yīng)濃度點的配制濃度。

標(biāo)準(zhǔn)曲線上各濃度點偏差的可接受范圍一般規(guī)定為：最低濃度點的偏差在±20%以內(nèi)，在其余各濃度點的偏差在±15%以內(nèi)。只有合格的標(biāo)準(zhǔn)曲線才能用于臨床待測樣品的濃度計算。當(dāng)線性范圍較寬時，推薦采用加權(quán)最小二乘法（weighted least square method）進行同歸計算。

（三）定量下限

定量下限（LLOQ）是標(biāo)準(zhǔn)曲線上的最低濃度點，：要求至少能滿足測定3～5個半衰期時樣品中的藥物濃度，或Cmax的1/10～1/20時的藥物濃度，其準(zhǔn)確度應(yīng)在真實濃度的80%～120%范圍內(nèi)。RSD應(yīng)小于20%，S/N應(yīng)大于5.應(yīng)由至少5個標(biāo)準(zhǔn)樣品測試結(jié)果證明。

（四）精密度與準(zhǔn)確度

要求選擇高、中、低3個濃度的質(zhì)控（quality control，QC）樣品同時進行方法的精密度和準(zhǔn)確度驗證。其中，低濃度接近定量下限（lower limit of quantitation，LLOQ），在LLOQ的3倍以內(nèi)；高濃度接近標(biāo)準(zhǔn)曲線的上限（即定量上限，upper limit of quantitation，ULOQ），中間選一個濃度，每一濃度至少測定5個樣品。

精密度用QC樣品的批內(nèi)（intra-batch）和批間（inter-batch）RSD表示，RSD一般應(yīng)小于15%，在LLOQ附近應(yīng)小于20%.

在測定批內(nèi)RSD時，每一濃度至少制備并測定5個樣品。為獲得批間RSD應(yīng)至少在不同天連續(xù)制備并測定3個分析批，至少45個樣品。

準(zhǔn)確度是指用特定方法測得的體內(nèi)樣品濃度與真實濃度的接近程度，一般應(yīng)在85%～115%范圍內(nèi)，在LLOQ附近應(yīng)在80%～120%范圍內(nèi)。

（五）樣品穩(wěn)定性

根據(jù)具體情況，對含藥體內(nèi)樣品在室溫、冰凍和凍融條件下以及不同存放時間進行穩(wěn)定性考察，以確定體內(nèi)樣品的存放條件和時間。還應(yīng)注意考查儲備液的穩(wěn)定性以及樣品處理后的溶液中分析物的穩(wěn)定性，以保證測試結(jié)果的準(zhǔn)確性和重現(xiàn)性。

（六）提取回收率

應(yīng)考察高、中、低3個濃度的提取回收率。其結(jié)果應(yīng)一致、精密和可重現(xiàn)。

（七）質(zhì)控樣品

質(zhì)控（QC）樣品系將已知量的待測藥物加入到生物介質(zhì)中配制的樣品，用于質(zhì)量控制。

（八）質(zhì)量控制

應(yīng)在體內(nèi)樣品分析方法驗證完成之后開始測試未知體內(nèi)樣品，每個樣品一般測定一次，必要時進行復(fù)測。每個分析批均應(yīng)建立相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線，并隨行測定高、中、低3個濃度的QC樣品，每個濃度至少雙樣本。并應(yīng)均勻分布在未知樣品測試順序中。當(dāng)一個分析批中未知樣品數(shù)目較多時，應(yīng)增加各濃度QC樣品數(shù)，使QC樣品數(shù)大于未知樣品總數(shù)的5%，QC樣品數(shù)的增加以組（高、中、低3個濃度）為單位。QC樣品測定結(jié)果的可接受標(biāo)準(zhǔn)為：偏差應(yīng)小于15%，低濃度點偏差應(yīng)小于20%，最多允許1/3不在同一濃度的QC樣品結(jié)果超限。如QC樣品測定結(jié)果不符合上述要求，則該分析批未知樣品測試結(jié)果作廢。濃度高于ULOQ的未知體內(nèi)樣品，應(yīng)采用相應(yīng)的空白介質(zhì)稀釋后重新測定。

（九）測試結(jié)果

應(yīng)詳細(xì)描述所用的分析方法，引用已有的參考文獻，提供每個分析批的標(biāo)準(zhǔn)曲線、質(zhì)控樣品及未知樣品的測試結(jié)果及計算過程。還應(yīng)提供全部未知樣品分析的色譜圖，包括全部相關(guān)的標(biāo)準(zhǔn)曲線、質(zhì)控樣品的色譜圖，以供審查。

（一）治療藥物監(jiān)測的對象

對于治療安全濃度范圍窄、治療劑量與中毒劑量接近、毒副作用強、具有非線性藥代動力學(xué)特征、長期使用藥效和毒性不明確、以及聯(lián)合用藥可能發(fā)生相互作用的藥物，通常都應(yīng)當(dāng)進行監(jiān)測。應(yīng)當(dāng)進行治療藥物監(jiān)測的藥物包括部分抗癲癇藥、抗心律失常藥、強心苷類藥、抗生素、抗精神病藥、抗哮喘藥、抗惡性腫瘤藥和一些解熱鎮(zhèn)痛藥，如表7-1所示。部分應(yīng)當(dāng)進行治療藥物監(jiān)測的藥物的治療濃度范圍和中毒濃度，如表7-2所示。治療藥物監(jiān)測示例見第十章第一節(jié)“苯巴比妥體內(nèi)樣品的分析。

（二）在藥代動力學(xué)研究中的應(yīng)用

地高辛在臨床上用于心衰治療，其有效濃度（0.8～2.0ng/ml）與中毒濃度（>2.4ng/ml）接近。消除半衰期長，成人的約為36小時、兒童的約為30小時，屬一級動力學(xué)。地高辛在腸部被吸收，60%～90%以原型經(jīng)腎小球濾過或腎小管排泌，僅有約10%在體內(nèi)通過氫化、水解、結(jié)合等反應(yīng)代謝，另有約7%發(fā)生腸-肝循環(huán)。

以毛地黃毒苷為內(nèi)標(biāo)，對人血漿和尿液中地高辛濃度LC-MS測定如下。

（1）樣品處理方法

（

2）色譜和質(zhì)譜條件

（3）測定結(jié)果