基本介紹

反義技術(shù)

優(yōu)點(diǎn)介紹

反義技術(shù)具有明顯的優(yōu)點(diǎn)

（1）反義核苷酸是針對(duì)特定的靶mRNA（DNA）的序列設(shè)計(jì)合成，具有極高的特異性；

（2）反義核酸是針對(duì)已知序列的靶基因設(shè)計(jì)合成的，由于靶基因序列已知，反義核酸僅有15-30個(gè)堿基，結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，容易設(shè)計(jì)和體外大量合成。

（3）反義核酸進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)與細(xì)胞周期無(wú)關(guān)，既可進(jìn)入增殖期細(xì)胞又可進(jìn)入非增殖期細(xì)胞。

（4）反義寡核苷酸不含病毒序列，不會(huì)產(chǎn)生免疫反應(yīng)，也不會(huì)整合入宿主染色體內(nèi)

相關(guān)應(yīng)用

確定靶基因后，針對(duì)該基因的外源反義核酸片段的設(shè)計(jì)合成有兩種途徑：

（1）重組于表達(dá)載體產(chǎn)生反義核酸片段，即利用DNA重組技術(shù)，在適宜的啟動(dòng)子和終止子間反向插入一段DNA于質(zhì)粒中，構(gòu)建于反義表達(dá)載體來(lái)合成反義核酸；

（2）人工合成反義寡核苷酸，即根據(jù)選定的靶基因序列，按照堿基互補(bǔ)原則，設(shè)計(jì)出反義寡核苷酸序列，以DNA自動(dòng)合成儀進(jìn)行合成。

（1）反義核酸在體內(nèi)是穩(wěn)定的；

（2）反義核酸必須能夠進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，并與靶基因有較高的親合力，且在作用濃度下不表現(xiàn)出明顯的細(xì)胞毒性；

（3）與靶序列的雜交能使靶基因的表達(dá)受抑制，且不作用于其它核酸序列及胞內(nèi)蛋白和類(lèi)脂化合物。

為使反義核酸序列只作用于唯一的靶基因，其最短序列應(yīng)是12-15個(gè)堿基，實(shí)驗(yàn)中的反義核酸多是15-30個(gè)堿基。增加反義核酸序列的長(zhǎng)度可以提高其結(jié)合能力及雜交復(fù)合體的穩(wěn)定性，但同時(shí)也增加了與其它mRNA非特異性同源序列結(jié)合的機(jī)會(huì)，并使其進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的能力降低。

大部分反義核酸是在胞漿內(nèi)與靶基因序列作用而形成雜交復(fù)合體的，所以靶基因（mRNA）中二級(jí)結(jié)構(gòu)少或無(wú)的區(qū)域，也就是mRNA啟動(dòng)子周?chē)男蛄?，是反義核酸的理想作用位點(diǎn)。對(duì)于核內(nèi)的mRNA，參與其加工和外運(yùn)的序列以及剪接位點(diǎn)處的序列是有效的靶基因序列。另外，5’-帽端是多數(shù)起動(dòng)子的結(jié)合位點(diǎn)，也是有效的靶基因區(qū)。

反義技術(shù)的一個(gè)重大挑戰(zhàn)是寡聚核苷酸的穩(wěn)定性，因?yàn)槲唇?jīng)修飾的寡聚核苷酸在生物體內(nèi)會(huì)被核酸酶迅速降解。反義實(shí)驗(yàn)中應(yīng)用到大量的化學(xué)修飾的核苷酸。一般來(lái)說(shuō)，核苷酸的修飾分為三類(lèi)：非天然堿基的類(lèi)似物、經(jīng)過(guò)修飾的糖（尤其是核糖的2'位置）、改變的磷酸骨架。

硫代磷酸酯寡聚脫氧核糖核酸（Phosphorothioate DNA Oligonucleotides，PS DNA ON）是第一代DNA類(lèi)似物的主要代表，被認(rèn)為是至今為止了解最多和應(yīng)用最廣泛的反義寡聚核苷酸。在這一類(lèi)寡聚核苷酸中，磷酸二酯鍵中的非橋氧原子被置換成硫原子。PS DNA ON的主要缺點(diǎn)是能與一些蛋白結(jié)合，這可以引起細(xì)胞毒性。但從藥物動(dòng)力學(xué)角度來(lái)看卻是有利的。與血漿蛋白的結(jié)合可以保護(hù)它們免遭過(guò)濾，使得它們?cè)谘逯械陌胨テ谘娱L(zhǎng)。PS DNA ON的另外一個(gè)缺點(diǎn)是與互補(bǔ)RNA的親和性會(huì)稍微降低與硫代磷酸酯寡聚脫氧核苷酸相關(guān)的問(wèn)題在第二代寡聚核苷酸中得到一定程度的解決。第二代寡聚核苷酸在核糖的2'位置含有烷基修飾。2'-O-甲基和2'-O-乙基是這類(lèi)修飾的兩個(gè)重要成員。具有這種修飾的寡聚核苷酸比硫代磷酸酯DNA的毒性低，并且與互補(bǔ)RNA的親和性也得到了稍微提高。然而這些有利的性質(zhì)被2'-O-烷基RNA不能激活RNaseH切割靶RNA這個(gè)缺點(diǎn)所抵消。

最近幾年，有多種經(jīng)過(guò)修飾的核酸被開(kāi)發(fā)，用于提高靶標(biāo)親和性、核酸酶抗性和藥物動(dòng)力學(xué)性質(zhì)?！皹?gòu)像限制”的概念被廣泛用于提高親和性和生物穩(wěn)定性。這些新類(lèi)型的核酸被歸為“第三代”反義試劑。

為提高反義核酸的局部轉(zhuǎn)染率，使其最大量地進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，可通過(guò)一定運(yùn)載系統(tǒng)將外源反義核酸通過(guò)上述方法轉(zhuǎn)移至局部細(xì)胞。常用載體有：

（1）脂質(zhì)體：將反義核酸的負(fù)電荷包裹后形成更易穿過(guò)細(xì)胞膜的脂溶性復(fù)合體，可明顯提高細(xì)胞的攝取能力，常用的脂質(zhì)體為陽(yáng)離子脂質(zhì)體，如DOTMA和DOTAP。

（2）病毒脂質(zhì)體運(yùn)載系統(tǒng)：可明顯提高轉(zhuǎn)染率。

（3）病毒：主要有逆轉(zhuǎn)錄病毒和腺病毒，前者主要作用于增生期細(xì)胞，轉(zhuǎn)染率低，但與宿主細(xì)胞核的整合能力強(qiáng)，整合后穩(wěn)定性強(qiáng)，可持續(xù)表達(dá)五個(gè)月以上；后者目前研究較多的是復(fù)制缺陷腺病毒，可作用于增殖期和靜止期細(xì)胞，轉(zhuǎn)染率高，但整合能力和穩(wěn)定性均較低，其細(xì)胞毒性和免疫反應(yīng)及感染生殖腺細(xì)胞限制了其在體內(nèi)的應(yīng)用。

（4）其它：如受體介導(dǎo)等，目前應(yīng)用尚不廣泛。

對(duì)于體外人工合成的反義寡核苷酸，主要應(yīng)用脂質(zhì)體、病毒脂質(zhì)體運(yùn)載系統(tǒng)或不用載體而直接局部給藥，對(duì)于應(yīng)用基因重組方法構(gòu)建的反義核酸表達(dá)載體，可用脂質(zhì)體或病毒載體一次性給藥，使其進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)后不斷產(chǎn)生反義核酸（細(xì)胞增殖時(shí)表達(dá)），達(dá)到長(zhǎng)期抑制的目的。

反義核酸的吸收取決于其序列長(zhǎng)度、荷電量、水/脂溶性及其濃度。熒光吖啶標(biāo)記的未修飾的核酸是通過(guò)受體介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)吞作用進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的，且已分離出分子量分別為34KD和80KD的兩種膜表面蛋白。對(duì)于修飾過(guò)的反義核酸，其主要吸收機(jī)制有所不同，但多數(shù)細(xì)胞表現(xiàn)為溫度及能量依賴性的細(xì)胞顆粒內(nèi)吞作用，37℃時(shí)吸收量最大。核素及熒光標(biāo)記的反義核酸在大多數(shù)細(xì)胞中先以顆粒形式內(nèi)化（Internalization）于內(nèi)吞小泡中，后期可達(dá)細(xì)胞核內(nèi)。

反義寡核苷酸抑制靶基因表達(dá)的確切機(jī)制尚不完全清楚。一般認(rèn)為有特異性和非特異性機(jī)制兩種。

特異性機(jī)制是指反義寡核苷酸與靶序列結(jié)合后通過(guò)以下途徑抑制靶基因的表達(dá)：

（1）與DNA結(jié)合成三鏈結(jié)構(gòu)或與單鏈DNA結(jié)合成雙鏈結(jié)構(gòu)以阻止靶基因的復(fù)制或轉(zhuǎn)錄；

（2）與靶mRNA結(jié)合形成雙鏈雜交體激活核酸酶H，裂解靶mRNA阻斷蛋白質(zhì)的翻譯；

（3）與mRNA AP位點(diǎn)結(jié)合干擾其剪接、加工和運(yùn)輸以終止蛋白質(zhì)的翻譯；

（4）占據(jù)酶結(jié)合位點(diǎn)，表達(dá)核酶，降解靶mRNA。

非特異性機(jī)制指非序列特異性藥理學(xué)效應(yīng)，或與細(xì)胞蛋白間反應(yīng)，為許多雙鏈核酸所共有，如雙鏈RNA（dsRNA）增加IFN的合成，激活兩種IFN誘導(dǎo)基因：2’，5’-寡腺苷酸合成酶（2’，5’-AS）和蛋白激酶P60。前者激活核酸內(nèi)切酶RnaseL降解靶mRNA，后者使真核細(xì)胞起始因子2（CIF-2）的α亞單位磷酸化導(dǎo)致啟動(dòng)mRNA的翻譯失敗，從而抑制蛋白質(zhì)的合成。dsRNA尚能活化腺苷酸環(huán)化酶使cAMP濃度升高。另外，尚有dsRNA誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞IL-1α表達(dá)的報(bào)道。

當(dāng)然，反義寡核苷酸的非特異性效應(yīng)有可能導(dǎo)致細(xì)胞毒性。體外大多數(shù)細(xì)胞能耐受100μmol/L濃度的反義寡核苷酸。

反義核酸的細(xì)胞毒作用與核酸的化學(xué)修飾基因、序列長(zhǎng)度及作用濃度和時(shí)間有關(guān)。一般而言，核酸序列愈長(zhǎng)、作用濃度愈大、時(shí)間愈久，毒性作用愈大。有關(guān)反義核酸在體內(nèi)的毒性研究較少，靜脈或腹腔注射硫代磷酸核苷酸后，在體內(nèi)迅速再分布，T1/2≈10-60分鐘，主要經(jīng)過(guò)尿液排泄，清除時(shí)間較長(zhǎng)，約20-40小時(shí)，這表明可以不必大量反復(fù)用藥即可使靶組織中具有一定治療濃度的反義核酸。然而，反義核苷酸可在如心、胃、腸等臟器中明顯聚集，這些非靶器官中集聚的反義核酸可產(chǎn)生非特異性地蛋白合成抑制作用，尤其是對(duì)骨髓和小腸等增生旺盛的器官；同時(shí)寡核苷酸降解后剩余的化學(xué)修飾堿基有摻合入DNA而引起突變或干擾DNA修復(fù)的可能。而局部應(yīng)用反義核苷酸可明顯減少其對(duì)遠(yuǎn)處組織的毒性作用。

臨床實(shí)驗(yàn)現(xiàn)狀

反義技術(shù)應(yīng)用廣泛，可以用于治療多種疾病，包括病毒感染、癌癥和炎癥（總結(jié)如下表）。

Product Company Target Disease Chemistry Status

Vitravene (Fomivirsen) ISIS Pharmaceuticals CMV IE2 CMV retinitis PS DNA Approved

Affinitac (ISIS 3521) ISIS PKC- Cancer PS DNA Phase III

Genasense Genta Bcl2 Cancer PS DNA Phase III

Alicaforsen (ISIS 2302) ISIS ICAM-1 Psoriasis, Crohn's disease, Ulcerative colitis PS DNA Phase II/III

ISIS 14803 ISIS Antiviral Hepatitis C PS DNA Phase II

ISIS 2503 ISIS H-ras Cancer PS DNA Phase II

MG98 Methylgene DNA methyl transferase Solid tumors PS DNA Phase II

EPI-2010 EpiGenesis Pharmaceuticals Adenosine A1 receptor Asthma PS DNA Phase II

GTI 2040 Lorus Therapeutics Ribonucleotide reductase (R2) Cancer PS DNA Phase II

ISIS 104838 ISIS TNF Rheumatoid Arthritis, Psoriasis 2nd generation Phase II

Avi4126 AVI BioPharma c-myc Restenosis, cancer, Polycystic kidney disease 3rd generation Phase I/II

Gem231 Hybridon PKA RI Solid tumors 2nd generation Phase I/II

Gem92 Hybridon HIV gag AIDS 2nd generation Phase I

GTI 2051 Lorus Therapeutics Ribonucleotide reductase (R1) Cancer PS DNA Phase I

Avi4557 AVI BioPharma CYP3A4 Metabolic redirection of approved drugs 3rd generation Phase I

1998年，第一個(gè)（也是至今為止唯一的一個(gè)）反義藥物Vitravene（Fomivirsen）被美國(guó)FDA批準(zhǔn)通過(guò)。這種硫代磷酸酯DNA被注射入玻璃體內(nèi)，以治療由巨細(xì)胞病毒（Cytomegalovirus）引起的艾滋病人的視網(wǎng)膜炎。Vitravene獲得批準(zhǔn)是參與反義領(lǐng)域的公司的一個(gè)里程碑。這種藥物滿足了感染者的需要，但是它的用處非常稀少，以至于只為ISIS制藥公司（USA）和Novartis公司（Switzerland）2001年帶來(lái)了15萬(wàn)7千美元銷(xiāo)售收入。

一些第二代寡核苷酸達(dá)到了臨床試驗(yàn)階段?？筎NFa的ISIS 104838正被用于治療炎癥的實(shí)驗(yàn)，比如風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和牛皮癬。Hybridon公司（USA）正在嘗試?yán)玫诙戳x分子治療癌癥和艾滋病病毒感染。核苷之間由硫代磷酸酯鏈接、兩端為四個(gè)2'-O-甲基核苷酸組成的混合骨架寡核苷酸被證明口服后在小鼠中有抗腫瘤活性。

現(xiàn)在用的最廣泛的反義分子仍然是硫代磷酸酯寡聚脫氧核苷酸，但是一些第二代和第三代化學(xué)分子正在進(jìn)行實(shí)驗(yàn)并且看來(lái)將提供更好的藥物動(dòng)力學(xué)性質(zhì)和口服給藥的機(jī)會(huì)。

相關(guān)問(wèn)題

總的來(lái)說(shuō)，越來(lái)越多的反義寡核苷酸進(jìn)入不同階段的臨床研究，并且涉及到越來(lái)越多的疾病，但目前仍存在一些問(wèn)題亟待解決，一是反義技術(shù)的應(yīng)用方面，包括：

（1）對(duì)反義核苷酸的化學(xué)修飾以提高其穩(wěn)定性，延長(zhǎng)其半衰期，增加其作用時(shí)間；

（2）反義核苷酸的轉(zhuǎn)移系統(tǒng)，尤其是局部腔內(nèi)轉(zhuǎn)移系統(tǒng)，包括載體系統(tǒng)的研究，使其靶組織最大效率地吸收反義核酸，以提高其作用效果；

（3）反義核酸作用機(jī)制的研究。

二是在臨床水平，主要是反義核酸的應(yīng)用劑量和作用時(shí)間及對(duì)降解產(chǎn)物毒性的作用研究，靶基因的選擇及應(yīng)用反義核酸的最佳時(shí)間。

總之，反義技術(shù)是一很有前途的基因治療方法。第三代核苷酸中的一些已經(jīng)被成功的應(yīng)用于體內(nèi)。在研究中已顯示出極好的臨床應(yīng)用前景，對(duì)以上問(wèn)題的解決將使其日臻完善，為更多疾病提供有力的臨床可行的治療手段。

隨著分子生物學(xué)和遺傳工程的發(fā)展，基因治療應(yīng)運(yùn)而生，反義技術(shù)是其中一種，它的基礎(chǔ)是根據(jù)核酸雜交原理設(shè)計(jì)針對(duì)特定靶序列的反義核酸，從而抑制特定基因的表達(dá)，包括反義RNA、反義DNA及核酶（Ribozyme），它們通過(guò)人工合成和生物合成獲得。

（一）反義RNA，根據(jù)反義RNA的作用機(jī)制可將其分為3類(lèi)：Ⅰ類(lèi)反義RNA直接作用于靶mRNA的S D序列和(或)部分編碼區(qū)，直接抑制翻譯，或與靶mRNA結(jié)合形成雙鏈RNA，從而易被RNA酶Ⅲ 降解；Ⅱ類(lèi)反義RNA與mRNA的非編碼區(qū)結(jié)合，引起mRNA構(gòu)象變化，抑制翻譯；Ⅲ類(lèi)反義RNA則直接抑制靶mRNA的轉(zhuǎn)錄。

(二)反義DNA是指一段能與特定的DNA或RNA以堿基互補(bǔ)配對(duì)的方式結(jié)合，并阻止其轉(zhuǎn)錄和翻譯的短核酸片段，主要指反義寡核苷酸，因更具藥用價(jià)值而倍受重視。

(三)核酶(ribozyme)是具有酶活性的RNA，主要參加RNA的加工與成熟。天然核酶可分為四類(lèi)：(1)異體催化剪切型，如RNaseP；(2)自體催化的剪切型，如植物類(lèi)病毒、擬病毒和衛(wèi)星RNA；(3)第一組內(nèi)含子自我剪接型，如四膜蟲(chóng)大核26SrRNA；(4)第二組內(nèi)含子自我剪接型。利用反義技術(shù)研制的藥物稱反義藥物。反義藥物作用于產(chǎn)生蛋白的基因，因此可廣泛應(yīng)用于多種疾病的治療，如傳染病、炎癥、心血管疾病及腫瘤等。與傳統(tǒng)藥物比較反義藥物更具選擇性及效率，因此也更高效低毒。基于上述特點(diǎn)反義藥物已成為藥物研究和開(kāi)發(fā)的熱點(diǎn)。而且反義技術(shù)還可以應(yīng)用于生物科學(xué)的基礎(chǔ)研究。