自20世紀(jì)80年代以來,人們逐漸了解了果寡糖的優(yōu)良生理特性。1982年,日本明治糖果株式會社首先進行工業(yè)化生產(chǎn)果寡糖。1983年,Hidaka采用一般的食品組分生產(chǎn)工藝分離和研制了果寡糖。1988年,Hirayama等研究了黑曲霉中屁-呋喃果糖苷酶的性質(zhì),分離、提純了該酶,并采用聚焦色譜法測定了該酶的純度和等電點。1990年,F(xiàn)ujita得到了β-呋喃果糖苷糖的三個同工酶。 經(jīng)過美國食品工藝師協(xié)會,應(yīng)用現(xiàn)代科學(xué)研究反復(fù)測試得出結(jié)論,現(xiàn)代酶法工藝酶化蔗糖生產(chǎn)的低聚果糖的分子結(jié)構(gòu)和保健功能,與天然存在于果蔬植物中的低聚果糖完全相同,是全天然的雙歧因子。云南天元低聚果糖在1998年分別經(jīng)中科院上海藥物所和北京醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院進行分離后,進行了氫1和碳13核磁振的測定,根據(jù)測試所獲譜峰結(jié)果證明,其分子結(jié)構(gòu)與日本文獻報道的GF2、GF3、GF4相同。 低聚果糖主要有兩大類生產(chǎn)工藝,一種是以蔗糖為原料,利用微生物發(fā)酵生產(chǎn)的β-果糖基轉(zhuǎn)移酶或β-呋喃果糖苷酶轉(zhuǎn)化而成;另一種是以菊粉為原料,采用酶水解生成。中國、日本和韓國等國家的主流生產(chǎn)方法是第一種方法,以蔗糖為原料,利用黑曲霉、鐮刀霉、日本曲霉等菌種分泌的β-呋喃果糖苷酶和盧-果糖基轉(zhuǎn)移酶進行酶反應(yīng),依次經(jīng)過濾、凈化、精制和濃縮而得到成品。工業(yè)生產(chǎn)上一般采用黑曲霉等產(chǎn)生的果糖轉(zhuǎn)移酶作用于高濃度(50%-60%)的蔗糖溶液,經(jīng)過一系列的酶轉(zhuǎn)移作用而獲得低聚果糖產(chǎn)品。目前,低聚果糖的生產(chǎn)工藝,已從第一代的液態(tài)發(fā)酵技術(shù)、第二代的固定化細(xì)胞催化技術(shù),發(fā)展到第三代固定化酶催化生產(chǎn)技術(shù)。 (一)酶水解法
菊芋→菊粉→水解→過濾→脫色→脫鹽→濃縮→低聚果糖
此法生成的低聚果糖鏈較長。
以菊芋為原料,熱水浸提獲得提取液,然后酶法處理提取液,使壓濾液流暢,提高低聚果糖出率達95%以上,應(yīng)用納濾高純化技術(shù)分離去除葡萄糖、果糖和蔗糖,使低聚果糖純度達94. 85%-98. 58%。
(二)黑曲霉發(fā)酵高濃度蔗糖法
以蔗糖為基質(zhì)進行發(fā)酵生產(chǎn)時,當(dāng)基質(zhì)蔗糖濃度低于0.5%,傾向于水解反應(yīng),主要生成葡萄糖和果糖;當(dāng)基質(zhì)蔗糖濃度提高到50%時,只有轉(zhuǎn)移反應(yīng)而不發(fā)生水解反應(yīng),低聚果糖的收率可超過60%。首先,將篩選出的高酶活黑曲霉株接種于濃度為5%-10%的蔗糖液培養(yǎng)基中,在28-30℃下振搖培養(yǎng)2-4d,獲得具有較高果糖轉(zhuǎn)移酶活性的黑曲霉菌體。為了有利于酶活性的提高,在培養(yǎng)基中可適當(dāng)添加氮源物質(zhì)(如蛋白胨和NH4 NO3,0.5%-0.75%)及無機鹽(如MgSO4和KH2PO4,0.1%-0.15%),再將這些菌體作用于50%~60%蔗糖溶液,在一定溫度和pH下催化產(chǎn)生低聚果糖。反應(yīng)結(jié)束后,發(fā)酵液的組成為:葡萄糖(36%-38%)、蔗糖(10%-12%)、果寡三糖(21%-28%)、果寡四糖(21%-24%)、果寡五糖(3%-6%),低聚果糖55%-60%。該法雖然使果寡糖產(chǎn)率得到大幅度提高,工藝設(shè)備簡單,但酶無法重復(fù)利用,自動化程度低,因而生產(chǎn)成本較高。 (三)固定化增殖細(xì)胞法
由黑曲霉等大多數(shù)真菌所產(chǎn)生的果糖轉(zhuǎn)移酶屬胞內(nèi)酶,故一般可直接采用固定化增殖細(xì)胞來連續(xù)化生產(chǎn)低聚果糖,用載體將產(chǎn)酶細(xì)胞進行包埋,得到固定化顆粒。將包埋產(chǎn)物與蔗糖或葡萄糖溶液反應(yīng),得到低聚果糖溶液,固定化酶可重復(fù)使用,又便于連續(xù)化生產(chǎn)。固定化黑曲霉菌體細(xì)胞的方法以采用海藻酸鈣包埋法為好,其他還有瓊脂包埋法、卡拉膠包埋法及微膠囊法等。將黑曲霉孢子與預(yù)先滅過菌的海藻酸鈉以一定的體積比混合,然后在其中滴入氯化鈣溶液,固化1h后收集固定化增殖細(xì)胞顆粒。將顆粒填人反應(yīng)柱,在50-60℃以下,以一定的速率通人50%蔗糖溶液,流出液經(jīng)過脫色、脫鹽、濃縮等工藝即可生產(chǎn)出液體低聚果糖。 (四)固定化酶法
先用黑曲霉發(fā)酵產(chǎn)生β-果糖轉(zhuǎn)移酶或β-呋喃果糖苷酶,再將菌體細(xì)胞破碎,分離純化出β-果糖轉(zhuǎn)移酶或盧-呋喃果糖苷酶,然后進行固定化處理。與固定菌體一樣,一般采用海藻酸鈉包埋法。將50%-60%的蔗糖糖漿在50-60℃下以一定速度通過固定化酶柱或固定化床生物反應(yīng)器,使酶催化蔗糖發(fā)生轉(zhuǎn)移反應(yīng),反應(yīng)時間控制在24h,再經(jīng)過一系列的脫色、脫鹽、濃縮等分離提純步驟,獲得占總產(chǎn)物60%左右的低聚果糖產(chǎn)品。因固定化酶具有很好的操作穩(wěn)定性,能反復(fù)使用,利用率高,可實現(xiàn)生產(chǎn)工藝連續(xù)化、自動化,生產(chǎn)成本降低,該法是目前國際上研究較多的方法。 (五)共固定化法
黑曲霉發(fā)酵高濃度蔗糖法、固定化增殖細(xì)胞法和固定化酶法生產(chǎn)果寡糖的反應(yīng)式:
GF(蔗糖)→GF2(果寡三糖) +GF3,(果寡四糖) +GF4(果寡五糖) +G(葡萄糖)
副產(chǎn)物葡萄糖既是平衡產(chǎn)物,影響化學(xué)推動力;又是屁-呋喃果糖苷酶的抑制物,阻遏蔗糖的進一步轉(zhuǎn)化。顯然,消除葡萄糖可以提高蔗糖的轉(zhuǎn)化率,工業(yè)上一般利用黑曲霉與其他酶(異構(gòu)酶、葡萄糖氧化酶)共包埋或協(xié)同作用的方法,如采用戊二醛與丹寧將葡萄糖氧化酶或異構(gòu)酶與黑曲霉交聯(lián)后再和海藻酸鈉結(jié)合,制成共包埋顆粒,再填入反應(yīng)柱,在生產(chǎn)低聚果糖的同時將副產(chǎn)物葡萄糖異構(gòu)化或氧化,從而解除了葡萄糖的抑制作用,可以得到含量分別為63%和71%的低聚果糖。 (六)純化
酶法或發(fā)酵法生產(chǎn)低聚果糖得到的低聚果糖含量并不高,為50%-60%,該產(chǎn)品也含有30%-35%的葡萄糖,10%-15%的蔗糖。這些副產(chǎn)物不但降低了低聚果糖的功能特性,也造成糖尿病人、肥胖者不能食用的現(xiàn)狀,限制了低聚果糖的應(yīng)用領(lǐng)域,不利于低聚果糖的普遍推廣。生產(chǎn)的低聚果糖溶液在投放市場之前,還需進一步加工處理,包括脫色、脫鹽、分離提純、濃縮和微生物滅菌等,可進一步得到低聚果糖含量大于95%的液體糖漿。
到目前為止,制備高純度低聚果糖的有以下幾種方法,凝膠過濾色譜法、納濾法、發(fā)酵法、酶法、離子交換色譜法。利用酵母消化低聚果糖產(chǎn)品中的葡萄糖,可生產(chǎn)高純度低聚果糖,將具有較弱轉(zhuǎn)化酶活性的酵母經(jīng)培養(yǎng)后添加于總糖濃度為20%的低聚果糖中,經(jīng)30℃、250r/min反應(yīng)24h,可制得純度為80.24%的低聚果糖。 早些年,國內(nèi)色譜分離技術(shù)產(chǎn)業(yè)化工藝不成熟,色譜分離技術(shù)制備高純度95%低聚果糖在國內(nèi)一直未被推廣。近幾年,上海某公司利用色譜分離技術(shù)提純功能糖取得了突破性進展,成功開發(fā)了模擬移動床技術(shù),協(xié)助國內(nèi)低聚果糖企業(yè)實現(xiàn)了高純度95%低聚果糖的產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn),縮小了與國際知名品牌的差距。在55型低聚果糖產(chǎn)品的基礎(chǔ)上,采用分離提純技術(shù)去掉絕大部分葡萄糖和蔗糖,經(jīng)過精制成為高純度95%低聚果糖。在諸多分離提純技術(shù)中,色譜分離技術(shù)經(jīng)濟實用,分離效率高,通過模擬移動床技術(shù)可實現(xiàn)連續(xù)生產(chǎn),分離提純低聚果糖。分離出來的葡萄糖和蔗糖還可以作為原料生產(chǎn)果葡糖漿,降低了高純度95%低聚果糖的生產(chǎn)成本,更利于低聚果糖在大眾食品中的推廣。 脫鹽對低聚果糖的品質(zhì)也有重要影響,不經(jīng)脫鹽處理,最終產(chǎn)品電導(dǎo)高,通常在100-300μS/cm,口感差,糖粉溶解后顏色深,透光率低,存在食品安全隱患,無法滿足下游產(chǎn)品要求。引入了脫鹽處理后的產(chǎn)品電導(dǎo)在10μS/m以內(nèi),口味純正,糖粉溶解后無色、透光率達到99%以上,達到國際先進水平,完全可以滿足下游產(chǎn)品要求。