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血藍蛋白
基本信息
| 中文名 | 血藍蛋白 |
| 外文名 | hemocyanin，haemocyanin |
介紹
它是在某些軟體動物、節(jié)肢動物(蜘蛛和甲殼蟲）的血淋巴中發(fā)現(xiàn)的一種游離的藍色呼吸色素。血藍蛋白含兩個直接連接多肽鏈的銅離子，與含鐵的血紅蛋白類似，它易于氧結(jié)合，也易與氧解離，是已知的惟一可與氧可逆結(jié)合的銅蛋白，氧化時呈青綠色，還原時呈白色。其分子量450000～1300000。節(jié)肢動物的血藍蛋白一條多肽鏈與一分子氧結(jié)合，含銅量0．17%；軟體動物的血藍蛋白一條多肽鏈則與6分子氧結(jié)合，含銅量0.025%。銅以二價形式與蛋白直接結(jié)合。血藍蛋白有多種催化作用，特別是變性后，在特定條件下具有多酚氧化酶、過氧化氫酶和脂氧化酶等活性。
在一些無脊椎動物中，多數(shù)動物的血液不含血紅蛋白，如軟體動物（頭足動物和石鱉屬等）以及節(jié)肢動物（蝦、蟹及肢口綱的鱟）所含的是血藍蛋白（亦稱為血藍素）。血藍蛋白分子由Cu2+和1個約200個以上氨基酸的肽鏈結(jié)合而成，和血紅蛋白一樣，該呼吸色素的顏色也與其狀態(tài)有關(guān)，在氧和狀態(tài)下為藍色，在非氧和狀態(tài)下則為無色或白色。
關(guān)鍵詞：載氧功能；抗病毒活性；抗菌活性；凝血功能。
血藍蛋白是節(jié)肢動物和軟體動物血淋巴中的含銅呼吸蛋白，脫氧狀態(tài)為無色，結(jié)合氧狀態(tài)為藍色。分子質(zhì)量一般為50ku～75ku，由7個或8個功能單位組成圓柱形結(jié)構(gòu)。組成血藍蛋白的亞單位數(shù)目較多，每個亞單位都含有2個Cu(Ⅰ）離子。不同蛋白質(zhì)所含亞單位數(shù)目不同，有些血藍蛋白的分子質(zhì)量可達9×103ku。軟體血藍蛋白是圓柱狀分子，含有10個～20個亞單位，每個亞單位（分子質(zhì)量為350ku～450ku）有7個～8個功能單元（氧分子結(jié)合部位）。節(jié)肢動物血藍蛋白由六聚體或多個六聚體組成，分子質(zhì)量約為3.5×103ku，每個亞單位（分子質(zhì)量為7.5ku）含有一個氧合中心。血藍蛋白的主要生物學功能與機體內(nèi)的輸氧有關(guān)，它與血紅蛋白（hemoglobins）和蚯蚓血紅蛋白（hemerythreins）并稱為動物界中的3種呼吸蛋白。但近年的研究表明，血藍蛋白是一種多功能蛋白，它不僅具有輸氧功能，而且還與能量的貯存、滲透壓的維持及蛻皮過程的調(diào)節(jié)有關(guān)。特別引起學術(shù)界重視的是，血藍蛋白還具有酚氧化物酶活性和抗菌功能，被認為是節(jié)肢動物和軟體動物中的一種重要的免疫分子。
結(jié)構(gòu)特點
血藍蛋白是蝦血淋巴中的含銅呼吸蛋白，每個氧結(jié)合位點有2個銅原子，其氧的結(jié)合位點與另一種銅離子結(jié)合蛋白——酚氧化酶的氧結(jié)合位點的結(jié)構(gòu)具有很高的相似性。血藍蛋白在脫氧狀態(tài)為無色，結(jié)合氧為藍色。
柱結(jié)合聚丙烯酰胺凝膠電泳(polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE）及電鏡技術(shù)，研究中國鱟魚血藍蛋白（hemocyanin）的結(jié)構(gòu)特點，結(jié)果表明經(jīng)Sephadex G100純化的血藍蛋白在PAGE電泳中出現(xiàn)4個條帶]，純化的血藍蛋白再經(jīng)DEAE32層析得到5個洗脫峰，每個峰在PAGE電泳下可分辨出4個條帶，電鏡下，血藍蛋白分子出現(xiàn)環(huán)形、五角形、十字形和蝴蝶結(jié)形等構(gòu)型并與其他解離的中間的構(gòu)型同時存在。
節(jié)肢動物門的螯肢類、甲殼類、多足類和蜘蛛中都含有血藍蛋白，其中最大的類群昆蟲雖不存在血藍蛋白，但含有與血藍蛋白有同源關(guān)系的六聚蛋白（hexamer）。六聚蛋白又分為富含芳香族氨基酸的和富含甲硫氨基酸的兩個類群。在節(jié)肢動物的近親有爪類（Onychophora）中也發(fā)現(xiàn)了節(jié)肢動物類型的血藍蛋白。節(jié)肢動物類型的血藍蛋白有四級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)。血藍蛋白的三級結(jié)構(gòu)，分子質(zhì)量約為75ku，其中第2個域為α螺旋區(qū)，螯合1對Cu+，可結(jié)合1個O2，下方為第3個域，由β折疊塊構(gòu)成并含有Ca離子，功能尚不詳。
節(jié)肢動物血藍蛋白至少已分化成為：①酚氧化酶原（prophenoloxidase）；②昆蟲的六聚蛋白（hexamer），不螯合Cu+，為貯藏蛋白；③甲殼類的假血藍蛋白（pseudohemocyanin或cryptocyanin），也為貯藏蛋白；④雙翅類的六聚蛋白受體。經(jīng)分子系統(tǒng)學的分析，它們與血藍蛋白相聚，共同構(gòu)建了節(jié)肢動物血藍蛋白基因超家族。
功能
載氧功能
血藍蛋白是以一價銅離子作為輔基的蛋白質(zhì)。它存在于軟體動物（如章魚、烏賊、蝸牛等）和節(jié)足動物（如螃蟹、蝦、蜘蛛等）的血液里。血藍蛋白的生理功能是輸氧。氧合血藍蛋白的銅是Cu（Ⅱ）并呈藍色，在347nm附近有吸收峰，這是由扭曲四面體場中的dd躍進產(chǎn)生的。脫氧血藍蛋白呈無色。X射線衍射技術(shù)大大增加了人們對血藍蛋白的認識。雖然目前仍未測出軟體血藍蛋白的晶體結(jié)構(gòu)，但為節(jié)肢動物血藍蛋白的晶體結(jié)構(gòu)分析提供了血藍蛋白分子活性部位的結(jié)構(gòu)信息。龍蝦血藍蛋白亞單位由3個結(jié)構(gòu)區(qū)域組成。區(qū)域Ⅰ為蛋白的前175個氨基酸殘基組，有大量的α螺旋二級結(jié)構(gòu)；區(qū)域Ⅱ大部分也為α螺旋二級結(jié)構(gòu)，由225個氨基酸殘基（176個～400個）和作氧分子鍵合部位的雙銅離子組成；剩余的258個氨基酸殘基（401個～658個）構(gòu)成區(qū)域Ⅲ，并且類似于如超氧化物歧化酶等其他蛋白的β折疊二級結(jié)構(gòu)。在區(qū)域Ⅱ的雙銅活性中心中，每個銅離子與3個組氨酸殘基的咪唑氮配位。未氧合時，2個銅離子相距約46pm，相互作用很弱，沒有發(fā)現(xiàn)2個銅離子之間存在著蛋白質(zhì)本身提供的橋基。此時，每個銅離子與3個組氨酸殘基咪唑氮的配位基本上是三角形幾何構(gòu)型。氧合后，Cu（Ⅱ）為四配位或五配位，兩個銅離子與兩個氧原子（過氧陰離子）和6個組氨酸殘基中最靠近銅離子的4個組氨基酸殘基咪唑氮強配位。此時，在一個近似的平面上，每個銅離子呈平面正方形幾何構(gòu)型，這是Cu（Ⅱ）最有利的配位狀況。氧分子以過氧橋形式在連接兩個Cu（Ⅱ），兩個Cu（Ⅱ）相距約36pm。
化學家對合成血藍蛋白的模型化合物頗感興趣。1978年Simmons M G和Wilson L J合成了以咪唑作為配體的Cu（Ⅰ）配合物，在室溫下無論是溶液或固體都能可逆載氧。用2，6二乙酰基吡啶與組胺縮合，得到配體2，6[1；（2；咪唑4亞乙基亞氨基）乙基]吡啶，然后在氮氣保護下加入[Cu（Ⅰ）（MeCN)4](ClO4）得到暗紅色的[Cu（Ⅰ）](ClO4）配合物。
該配合物在溶液中以單體形式存在。Cu（Ⅰ）離子的配位數(shù)為5。在室溫下露置于空氣中，溶液迅速從紅色變?yōu)榫G色，約2min后反應(yīng)完全，每2 mol Cu（Ⅰ）吸收1 mol O2。如果把載氧后的溶液溫熱至40℃左右并用氮氣趕跑氣體，或在減壓下攪拌溶液，很容易發(fā)生放氧逆反應(yīng)，溶液恢復原來的紅色。如此重復實驗證實它能可逆載氧。據(jù)此推測可能存在下列反應(yīng)LCuⅠ+O2??LCuⅡO LCuⅡO + CuIL??LCuⅡO CuⅡL。
抗病毒作用
血藍蛋白具有非特異性抗病毒作用。應(yīng)用親和層析從斑節(jié)對蝦(Penaeus monodon）血清中分離出2種能與白斑桿狀病毒（White spot syndrome virus ，WSSV）和虹彩病毒(Singapore grouper irido virus，SGⅣ）結(jié)合的多肽，分子質(zhì)量分別為73 ku和75 ku，經(jīng)質(zhì)譜分析鑒定為血藍蛋白，將血藍蛋白和病毒混合后添加到細胞培養(yǎng)液，培養(yǎng)3 d后發(fā)現(xiàn)細胞只受到較輕微的破損。而不含血藍蛋白的對照組細胞則完全裂解。如果延長培養(yǎng)時間，試驗組細胞也相繼裂解。隨后選用6種DNA 或RNA病毒（SGⅣ、FV3、LDV、ThRV、ABV和IPNV）進行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其半抑制濃度（Semiinhibitory concentration，ECs）約為4.56 mg/L～6.64 mg/L。這些結(jié)果表明，血藍蛋白在低濃度時是潛在的病毒抑制物，但血藍蛋白不能完全抑制病毒的復制。
研究發(fā)現(xiàn)血藍蛋白的兩個亞基在免疫功能上有很大差異，Lei K Y等報道，血藍蛋白的兩個分子質(zhì)量73ku和75ku的亞基，只有75ku的PjHcL亞基具有抗病毒功能，PjHcY亞基不具有抗病毒功能，它意味著這兩個血亞基可能起不同的角色。從序列和結(jié)構(gòu)的比較發(fā)現(xiàn)，盡管這兩個亞基是高度保守的，它們表現(xiàn)出一定的差異在N端域和C端域。比對兩個亞基的氨基酸結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，在銅離子結(jié)合位點及第2功能區(qū)兩個亞基結(jié)構(gòu)完全相同，只有在第3功能區(qū)PjHcL亞基和PjHcY亞基的氨基酸α、β構(gòu)型不同。Lei等采用RTPCR技術(shù)精確驗證了這一結(jié)果，并且發(fā)現(xiàn)了兩個亞基的不同免疫功能，為以后研究血藍蛋白的免疫學功能提供了更明確的依據(jù)。
總之，血藍蛋白的免疫防御功能是近年來無脊椎動物免疫學領(lǐng)域的最新發(fā)現(xiàn)，在免疫反應(yīng)中，僅可表現(xiàn)出酚氧化酶的功能，而且可裂解產(chǎn)生不同分子質(zhì)量大小的抗菌片段以抵御病原的入侵。雖然其免疫機理目前尚不十分明確，但隨著無脊椎動物上的演變相信其確實情況必將闡明。
凝集作用
近年來國內(nèi)外研究表明，血藍蛋白及其裂解片段具有多種免疫功能。章躍陵以采自汕頭的南美白對蝦為研究對象，采用親和層析、PAGE、SDSPAGE、Western blot、血細胞凝集試驗和糖抑制試驗等方法探索南美白對蝦血藍蛋白的血細胞凝集活性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，血藍蛋白對試驗所選用的魚、雞、鼠和人等4種紅細胞均具有顯著的血細胞凝集活性，凝集活性大小為5 mg/L～10 mg/L，而且其凝集反應(yīng)可被α；半乳糖、αD葡萄糖、甘露醇和N乙酰神經(jīng)氨酸等4種糖所顯著抑制。不過，與一般的凝集素相比，血藍蛋白的凝集活性大概低1個～2個數(shù)量級，它在蝦血清中含量上的豐富也許可以彌補其凝集活性上的不足。既往研究中，發(fā)現(xiàn)血藍蛋白蛋白斑點的肽質(zhì)量譜峰值可以與流感病毒的血凝素相匹配，其序列覆蓋率為37%。由此推測，血藍蛋白確實具有血細胞凝集活性，這對進一步研究血藍蛋白的免疫學功能具有重要意義。
研究證實，血藍蛋白可能由酚氧化酶進化而來，酚氧化酶級聯(lián)系統(tǒng)的激活又與甲殼動物體內(nèi)凝血蛋白的凝血機制緊密相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)血藍蛋白也具有凝集活性。這些研究結(jié)果提示，血藍蛋白、酚氧化酶及凝血蛋白可能是由同一蛋白進化而來，而血藍蛋白這一多功能分子卻保留了它們?nèi)康拿庖邔W功能。
抗菌作用
血藍蛋白裂解產(chǎn)生的抗微生物肽與對蝦的免疫反應(yīng)有關(guān)。近來又在大西洋白對蝦和凡納對蝦的血淋巴中分離到3種帶負電荷的抗真菌活性肽類，與血藍蛋白C端序列的一致性達95%～100%。當對蝦被感染后，血淋巴中這種血藍蛋白C端序列的活性肽濃度升高，這表明血藍蛋白的裂解是由生物學信號引起的。Lee S Y等從淡水螯蝦血漿中得到一種由16個氨基組成的抗菌肽，能抑制G+和G－細菌的生長。這種抗菌肽是血藍蛋白在酸性條件下經(jīng)蛋白酶剪切產(chǎn)生。注射脂多糖和葡聚糖可促進血藍蛋白產(chǎn)生和釋放這種肽。這說明抗微生物肽可以被誘導、釋放和激活，從而在肌體的免疫防御中起作用。Zhang Y L等還在凡納對蝦血清中分離到一種能與羊抗人IgG特異性反應(yīng)的IgG樣蛋白，經(jīng)檢測為血藍蛋白。研究發(fā)現(xiàn)，除銅結(jié)合位點外，在此血藍蛋白的C端還存在一個由252個氨基酸組成的似Ig的保守區(qū)域。此外，還在血藍蛋白和Ig的重鏈和k鏈分別發(fā)現(xiàn)4個和1個相似保守區(qū)域。很有可能這些相似Ig的保守區(qū)域賦予了甲殼動物呼吸色素新的功能，使其更好地發(fā)揮抗微生物作用。雖然到目前為止，血藍蛋白的加工機制還不十分清楚，但它們在甲殼動物免疫系統(tǒng)中所起的作用不容忽視，因此進行深入細致的研究，搞清楚其免疫機制，對于甲殼類經(jīng)濟動物的疾病控制是至關(guān)重要的。
近年來，隨著血藍蛋白多種功能的不斷發(fā)現(xiàn)，特別是免疫活性的發(fā)現(xiàn)，血藍蛋白的功能、作用機理、進化地位已經(jīng)引起各國學者的濃厚興趣。進一步研究血藍蛋白功能對于豐富和發(fā)展無脊椎動物，特別是甲殼類動物生理生化和免疫系統(tǒng)的基礎(chǔ)研究，探索免疫這些結(jié)果表明，血藍蛋白具有廣譜抗細菌、真菌、病毒功能及獨特的作用機理，有可能成為抗菌、抗病毒及抗腫瘤藥物的新來源。中國是海洋大國，開發(fā)和利用海洋動物血藍蛋白資源，將為研制抗菌新藥提供理想分子設(shè)計骨架和模板，為發(fā)展新的抗感染藥物奠定重要基礎(chǔ)。此外，蝦類血藍蛋白的研究加深了人們對低等脊椎動物免疫防御機制的認識，為日益嚴重的蝦類病害防治開辟了嶄新的途徑。同時，隨著蝦類轉(zhuǎn)基因技術(shù)的發(fā)展，人們有可能通過轉(zhuǎn)血藍蛋白基因獲得抗病新品種?？梢韵嘈?，隨著研究的不斷深入，蝦類血藍蛋白將對世界水產(chǎn)漁業(yè)的可持續(xù)發(fā)展起到重要的作用。
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