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金黃色葡萄球菌
人類(lèi)的一種重要病原菌
金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus，S. aureus）是人類(lèi)的一種重要病原菌，隸屬于葡萄球菌屬（Staphylococcus），有“嗜肉菌"的別稱(chēng)，是革蘭氏陽(yáng)性菌的代表，可引起許多嚴(yán)重感染。而對(duì)于金黃色葡萄球菌在速凍食品中的存在量，衛(wèi)生部于2011年11月24日公布食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)《速凍面米制品》，允許金葡菌限量存在。
簡(jiǎn)介
金黃色葡萄球菌
新出現(xiàn)的耐甲氧西林金黃色葡萄球菌，被稱(chēng)作超級(jí)細(xì)菌，幾乎能抵抗人類(lèi)所有的藥物，但是萬(wàn)古霉素可以對(duì)付它。典型的金黃色葡萄球菌為球型，直徑0.8μm左右，顯微鏡下排列成葡萄串狀。金黃色葡萄球菌無(wú)芽胞、鞭毛，大多數(shù)無(wú)莢膜，革蘭氏染色陽(yáng)性。金黃色葡萄球菌營(yíng)養(yǎng)要求不高，在普通培養(yǎng)基上生長(zhǎng)良好，需氧或兼性厭氧，最適生長(zhǎng)溫度37°C，最適金黃色葡萄球菌普通培養(yǎng)基培養(yǎng)特點(diǎn)生長(zhǎng)pH7.4，干燥環(huán)境下可存活數(shù)周。平板上菌落厚、有光澤、圓形凸起，直徑0.5~1.0mm。血平板菌落周?chē)纬赏该鞯娜苎h(huán)。金黃色葡萄球菌有高度的耐鹽性，可在10~15%NaCl肉湯中生長(zhǎng)?？煞纸?/span>葡萄糖、麥芽糖、乳糖、蔗糖，產(chǎn)酸不產(chǎn)氣。甲基紅反應(yīng)陽(yáng)性，VP反應(yīng)弱陽(yáng)性。許多菌株可分解精氨酸，水解尿素，還原硝酸鹽，液化明膠。金黃色葡萄球菌具有較強(qiáng)的抵抗力，對(duì)磺胺類(lèi)藥物、青霉素、紅霉素、土霉素、新霉素等抗生素敏感，但易產(chǎn)生耐藥性，原因是由于這些菌株產(chǎn)生青霉素酶等。對(duì)堿性染料敏感，十萬(wàn)分之一的龍膽紫液即可抑制生長(zhǎng)。
金黃色葡萄球菌是常見(jiàn)的食源性致病菌，廣泛存在于自然環(huán)境中。金黃色葡萄球菌在適當(dāng)?shù)臈l件下，能夠產(chǎn)生腸毒素，引起食物中毒。近幾年，金黃色葡萄球菌引發(fā)的食物中毒報(bào)道層出不窮，由金黃色葡萄球菌引起的食物中毒占食源性微生物食物中毒事件的25%左右，金黃色葡萄球菌成為僅次于沙門(mén)氏菌和副溶血桿菌的第三大微生物致病菌。
金黃色葡萄球菌對(duì)高溫有一定的耐受能力，在80℃以上的高溫環(huán)境下30min才可以將其徹底殺死，另外金黃色葡萄球菌可以存活于高鹽環(huán)境，最高可以耐受15%濃度的NaCl溶液。由于細(xì)菌本身結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，利用70%的乙醇可以在幾分鐘之內(nèi)將其快速殺死。金黃色葡萄球菌代謝類(lèi)型為需氧或兼性厭氧，對(duì)環(huán)境要求不高，37℃為最適生長(zhǎng)溫度，能在各種惡劣環(huán)境中存活下來(lái)，因此，用一般的營(yíng)養(yǎng)瓊脂即可正常培養(yǎng)細(xì)菌。
流行病學(xué)
金黃色葡萄球菌
金黃色葡萄球菌的流行病學(xué)一般有如下特點(diǎn)：季節(jié)分布，多見(jiàn)于春夏季；中毒食品種類(lèi)多，如奶、肉、蛋、魚(yú)及其制品。此外，剩飯、油煎蛋、糯米糕及涼粉等引起的中毒事件也有報(bào)道。上呼吸道感染患者鼻腔帶菌率83%，所以人畜化膿性感染部位，常成為污染源。
金黃色葡萄球菌是人類(lèi)化膿感染中最常見(jiàn)的病原菌，可引起局部化膿感染，也可引起肺炎、偽膜性腸炎、心包炎等，甚至敗血癥、膿毒癥等全身感染。金黃色葡萄球菌的致病力強(qiáng)弱主要取決于其產(chǎn)生的毒素和侵襲性酶：
a.溶血毒素：外毒素，分α、β、γ、δ四種，能損傷血小板，破壞溶酶體，引起肌體局部缺血和壞死。
e.腸毒素：金黃色葡萄球菌能產(chǎn)生數(shù)種引起急性胃腸炎的蛋白質(zhì)性腸毒素，分為A、B、C1、C2、C3、D、E及F八種血清型。腸毒素可耐受100°C煮沸30分鐘而不被破壞。它引起的食物中毒癥狀是嘔吐和腹瀉。此外，金黃色葡萄球菌還產(chǎn)生溶表皮素、明膠酶、蛋白酶、脂肪酶、肽酶等。
f.表皮剝脫毒素：引起燙傷樣皮膚綜合征，又稱(chēng)剝脫樣皮炎。
g.毒性休克綜合征毒素（tsst-1）腸毒素是一種單鏈小分子蛋白，分子量約26-29kDa，相對(duì)分子質(zhì)量較低，具有熱穩(wěn)定性，對(duì)人體腸道產(chǎn)生破壞，導(dǎo)致嘔吐腹瀉等癥狀。目前研究已發(fā)現(xiàn)多種類(lèi)型的腸毒素或類(lèi)腸毒素，除傳統(tǒng)腸毒素A(SEA)、B(SEB)、C(SEC)、D(SED)、E(SEE)之外，SEG、SEH、SEI、SEJ、SEK、SEL、SEM、SEN、SEO、SEP、SEQ、SER、SEU和SEV等腸毒素也不斷被發(fā)現(xiàn)。
引發(fā)病癥
金黃色葡萄球菌
球菌檢驗(yàn)
金黃色葡萄球菌
增菌培養(yǎng)：將10-1稀釋液接入7.5%NaCl肉湯或胰蛋白胨肉湯中，37°C培養(yǎng)24小時(shí)。
分離培養(yǎng)：將上述稀釋液或培養(yǎng)液分別劃線(xiàn)血平板和Baird-Parker平板，置37°C培養(yǎng)24~48小時(shí)。金黃色葡萄球菌在血平板上呈金黃或白色菌落，大而凸起，表面光滑，周?chē)腥苎?。在Baird-Parker平板上菌落為圓形，直徑2~3mm，顏色灰或黑色，周?chē)幸粶啙釒А?/span>
染色觀(guān)察：從平板上挑取可疑性菌落進(jìn)行革蘭氏染色，金黃色葡萄球菌為革蘭氏陽(yáng)性，顯微鏡下呈葡萄狀排列無(wú)芽胞、莢膜，直徑0.5~1μm。
血漿凝固酶試驗(yàn)：吸取0.5mL兔血漿與0.5mL金黃色葡萄球菌試液浸液肉湯24小時(shí)培養(yǎng)物充分混勻，置36±1°C培養(yǎng)，每隔半小時(shí)觀(guān)察一次，連續(xù)觀(guān)察6小時(shí)，出現(xiàn)凝固，即將小試管傾斜或倒置時(shí)，內(nèi)容物不流動(dòng)，判為陽(yáng)性。同時(shí)做陰陽(yáng)性對(duì)照。耐熱核酸酶試驗(yàn)：將24小時(shí)肉湯培養(yǎng)物沸水浴處理15min，用接種環(huán)劃線(xiàn)刺種于甲苯胺蘭-DNA平板，36±1°C培養(yǎng)24小時(shí)，在刺種線(xiàn)周?chē)霈F(xiàn)淡粉色者為陽(yáng)性。本試驗(yàn)金黃色葡萄球菌為陽(yáng)性。
第二，金黃色葡萄球菌腸毒素檢測(cè)
金黃色葡萄球菌腸毒素的檢測(cè)主要有動(dòng)物試驗(yàn)、血清學(xué)試驗(yàn)、免疫熒光試驗(yàn)及酶聯(lián)免疫吸附等方法，在此就不一一贅述。
防控措施
1.合理選擇食品原料和配料，使用安全的水和食物原料，改善加工環(huán)境的衛(wèi)生和操作者的個(gè)人衛(wèi)生習(xí)慣，避免金黃色葡萄球菌對(duì)食品的污染。
2.牢記在安全的溫度下保存食物，生熟分開(kāi)，建議食物應(yīng)該現(xiàn)做現(xiàn)吃。盡可能采取熱處理確保殺滅細(xì)菌，熱處理后避免二次污染。
3.對(duì)已感染或攜帶某種病原體的食品加工人員，應(yīng)依據(jù)有關(guān)法律法規(guī)，限制其從事食品加工活動(dòng)。
4.生產(chǎn)加工乳制品、肉類(lèi)等高危食品的企業(yè)，應(yīng)認(rèn)真、嚴(yán)格的執(zhí)行食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)的相關(guān)規(guī)定。在加工過(guò)程中或在市場(chǎng)流通中發(fā)現(xiàn)產(chǎn)品檢驗(yàn)的某些指標(biāo)不符合食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)，應(yīng)以消費(fèi)者利益為重，自覺(jué)把控出廠(chǎng)產(chǎn)品的質(zhì)量、主動(dòng)召回不合格產(chǎn)品，防范引起中毒事件的潛在風(fēng)險(xiǎn)。
5.政府相關(guān)部門(mén)要加強(qiáng)我國(guó)食品中金黃色葡萄球菌安全的風(fēng)險(xiǎn)識(shí)別和風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估研究工作。重視并持續(xù)開(kāi)展預(yù)防和控制食源性疾病的宣傳教育，及時(shí)提醒消費(fèi)者一旦發(fā)生疑似金黃色葡萄球菌腸毒素中毒，除立即將患者送往醫(yī)院進(jìn)行救治外，還要立即停止食用并封存可疑食品。同時(shí)對(duì)食品生產(chǎn)、加工、經(jīng)營(yíng)人員，普及預(yù)防食源性疾病的衛(wèi)生學(xué)知識(shí)。
感染處理
限量標(biāo)準(zhǔn)
我國(guó)國(guó)家衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會(huì)于2013年發(fā)布《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中致病菌限量》(GB29921-2013)，在國(guó)標(biāo)中制定了金黃色葡萄球菌的限量標(biāo)準(zhǔn)，規(guī)定熟肉制品、熟制水產(chǎn)品、熟制糧食制品等8大類(lèi)食品中，同批次采集5份樣品，每份樣品中的金黃色葡萄球菌濃度均不得超出1000CFU/g，僅允許其中1份樣品在100~1000CFU/g之間。
傳播途徑
一般來(lái)說(shuō)，金黃色葡萄球菌可通過(guò)以下途徑污染食品：食品加工人員、炊事員或銷(xiāo)售人員帶菌，造成食品污染；食品在加工前本身帶菌，或在加工過(guò)程中受到了污染，產(chǎn)生了腸毒素，引起食物中毒；熟食制品包裝不嚴(yán)，運(yùn)輸過(guò)程受到污染；奶牛患化膿性乳腺炎或禽畜局部化膿時(shí)，對(duì)肉體其他部位的污染。
培養(yǎng)方式
檢測(cè)方法
傳統(tǒng)分離鑒定方法
世界上對(duì)食品中金黃色葡萄球菌的檢測(cè)通常采用生化鑒定的手段，并在初期采用平板劃線(xiàn)分離。當(dāng)前我國(guó)檢測(cè)食品中金黃色葡萄球菌依據(jù)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)《食品微生物學(xué)檢驗(yàn)金黃色葡萄球菌檢驗(yàn)》(GB4789.10-2016)中的方法進(jìn)行。國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)執(zhí)行內(nèi)容包括定性檢測(cè)和定量檢測(cè)兩部分。在無(wú)菌條件下接種到肉湯中進(jìn)行前增菌，最后將培養(yǎng)物接種劃線(xiàn)，根據(jù)生化鑒定方法進(jìn)行血清學(xué)鑒定。傳統(tǒng)生化鑒定方法操作簡(jiǎn)單，穩(wěn)定性強(qiáng)，成本低，是目前最常用的鑒定方法。
免疫學(xué)檢測(cè)方法
免疫學(xué)檢測(cè)方法主要是基于免疫學(xué)理論研究，其是通過(guò)設(shè)計(jì)的抗原、抗體和免疫細(xì)胞，檢測(cè)抗原和抗體的結(jié)合以及免疫細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子的，從而達(dá)到檢測(cè)目的一種實(shí)驗(yàn)方法。該技術(shù)方法主要包括酶聯(lián)免疫法、免疫熒光法、免疫膠體金法等。
①酶聯(lián)免疫法：其原理是利用抗體與抗原在載體表面的特異性結(jié)合，加入某種酶，酶與抗體或抗原結(jié)合在一起，從而形成可以跟蹤抗體或抗原的標(biāo)記物，由于抗原或抗體與受檢樣品的反應(yīng)產(chǎn)生抗原或抗體的復(fù)合物，此時(shí)加入酶反應(yīng)顯色底物，產(chǎn)物的量的大小與檢測(cè)物質(zhì)的量的大小呈正相關(guān)，分析顯色情況從而確定樣品中待檢測(cè)物的含量。目前已經(jīng)開(kāi)發(fā)了幾種根據(jù)ELISA技術(shù)用于檢測(cè)培養(yǎng)上清液和食物樣品(例如干酪，土豆沙拉，火腿和牛奶)中的金黃色葡萄球菌。
②免疫熒光法：免疫熒光技術(shù)利用熒光色素對(duì)抗體或抗原進(jìn)行標(biāo)記，然后檢測(cè)目標(biāo)抗原或抗體?？乖涂贵w特異結(jié)合后，通過(guò)考察熒光信號(hào)的強(qiáng)弱進(jìn)行定性定量檢測(cè)。與酶介導(dǎo)的免疫測(cè)定相比，基于熒光的免疫測(cè)定具有提供高通量分析和靈敏度的更大潛力。
③免疫膠體金法：該方法借助硝酸纖維膜為固定相載體，樣品溶液通過(guò)毛細(xì)作用在試紙條中移動(dòng)，在試紙條中同時(shí)加入了針對(duì)待檢測(cè)物質(zhì)特異性的抗原或抗體。與ELISA技術(shù)相比，免疫膠體金技術(shù)操作更為簡(jiǎn)單，對(duì)實(shí)驗(yàn)人員沒(méi)有特別的技術(shù)要求，適合基層單位和現(xiàn)場(chǎng)診斷。但是免疫膠體金相比較ELISA法而言，靈敏度更低，且使用范圍不廣，需要進(jìn)一步的研究?？傮w而言，免疫膠體金有著強(qiáng)大的發(fā)展?jié)摿蛷V闊的應(yīng)用前景。
分子生物學(xué)檢測(cè)方法
該技術(shù)主要包括聚合酶鏈反應(yīng)（PolymeraseChainReaction，PCR）技術(shù)，核酸探針技術(shù)，環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)等技術(shù)。
①聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)：該方法的原理是在DNA聚合酶的作用下，游離的脫氧核糖核酸參照堿基互補(bǔ)配對(duì)的原則，以模板DNA為主鏈，通過(guò)提供一段引物，迅速的擴(kuò)增DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)。PCR技術(shù)特異性強(qiáng)、敏感度高，已廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)、生物學(xué)等領(lǐng)域中。PCR作為致病微生物的檢測(cè)方法，穩(wěn)定性強(qiáng)，是目前主流的檢測(cè)方法。在微生物檢測(cè)應(yīng)用中，引物的設(shè)計(jì)以及靶序列的選擇是PCR方法的核心。PCR法同時(shí)也有一定的局限性，由于該方法需要對(duì)樣品進(jìn)行增菌，食品成分復(fù)雜，會(huì)對(duì)實(shí)驗(yàn)造成干擾。與其他方法相比，PCR技術(shù)儀器設(shè)備價(jià)格高，需要花費(fèi)的成本較高，推廣普及需要一定的時(shí)間和資金支持。
②核酸探針技術(shù)：通過(guò)使用基因特異性核苷酸序列作為探針與目的DNA雜交的一種核酸雜交技術(shù)，通過(guò)檢測(cè)該段特異性的標(biāo)記物，從而判斷是否含有目標(biāo)微生物。核酸探針具有分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)的靈敏度高、特異性強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)，但是實(shí)驗(yàn)周期長(zhǎng)，操作繁瑣，如果樣品中目標(biāo)微生物含量過(guò)低，極易造成樣品目標(biāo)微生物未檢出，出現(xiàn)假陰性的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
③環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)：該技術(shù)基于DNA擴(kuò)增技術(shù)，能夠在恒溫條件下，根據(jù)設(shè)計(jì)的多對(duì)引物，利用鏈置換型DNA聚合酶快速的進(jìn)行核酸的擴(kuò)增。與PCR方法比較，環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增法操作更加快捷簡(jiǎn)單，花費(fèi)成本較低，且對(duì)儀器要求低，能夠廣泛利用在食源性致病微生物的檢測(cè)中。
其他方法
試劑盒法：試劑盒法通常將十多種，甚至幾十種培養(yǎng)基或成分集中在特定微型裝置內(nèi)，通過(guò)觀(guān)察微生物的生長(zhǎng)和代謝過(guò)程的某些產(chǎn)物或現(xiàn)象，對(duì)試驗(yàn)現(xiàn)象進(jìn)行分析，將傳統(tǒng)試驗(yàn)中多次試驗(yàn)通過(guò)一次完成，縮短了檢測(cè)時(shí)間。此法可大大縮短測(cè)試時(shí)間，在24h內(nèi)得出結(jié)果，甚至某些可縮短至4h內(nèi)。目前，用于檢測(cè)金黃色葡萄球菌的成品試劑盒有API、MIS等。
測(cè)試片法：其將紙膜、紙片或膠片附著相關(guān)培養(yǎng)基和特定顯色液作為金葡菌的培養(yǎng)載體，依據(jù)金葡菌在載體上的生長(zhǎng)以及顯色情況，來(lái)衡量食品中金黃色葡萄球菌的存在數(shù)量，該方法簡(jiǎn)便易行，但結(jié)果精度不高。
參考資料
[1]
金黃色葡萄球菌性邊緣性角膜炎的檢查項(xiàng)目有哪些？[引用日期2015-09-04]
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